分泌型卷曲相关蛋白在散发性结直肠癌发生中的作用

摘要

目的:(1)研究分泌型卷曲相关蛋白(SFRP)基因启动子区CpG岛甲基化与结直肠癌的关系。(2)研究SFRP在结直肠癌组织中的表达情况。(3)检测SFRP4基因转染肠癌细胞株HCT116后基因表达谱的变化,为进一步探讨SFRP4在结直肠癌发生中的作用机制奠定实验基础。
　　 方法:(1)运用甲基化特异性PCR(MSP)技术检测20对结直肠癌及相应癌旁组织中SFRPs基因启动子区CpG岛甲基化状况,TA克隆测序验证MSP产物。5-氮杂-2'-脱氧胞苷对结直肠癌细胞株HCT116、SW480进行去甲基化处理,采用MSP和WesternBlot法分别检测细胞株中SFRPs基因甲基化和蛋白表达。(2)应用实时定量RT-PCR技术分析20对结直肠癌及癌旁正常组织中SFRPsmRNA的表达水平,通过Westernblot方法进行验证后,进一步运用免疫组化技术检测206例结直肠组织中SFRP1和SFRP4蛋白表达水平。(3)通过脂质体介导的基因转染构建稳定表达SFRP4的肠癌细胞系,以SFRP4转染组为实验组,空白质粒转染组为对照组,利用高通量的基因表达谱芯片Affymetrixarray筛选差异表达基因,并挑选部分差异表达基因用RT-PCR技术进一步验证。
　　 结果:(1)SFRP1、2、4、5在结直肠癌中甲基化率分别为95％(19/20)、85％(17/20)、15％(3/20)、65％(13/20);癌旁组织中分别为60％(12/20)、40％(8/12)、5％(1/20)、35％(7/20)。结直肠癌中SFRP1、2、5甲基化率均高于与癌旁组织,差异具有统计学意义(P＜0.05);而结直肠癌与癌旁组织SFRP4甲基化率差异无统计学意义(P＞0.05)。HCTll6细胞株SFRP1、2、4、5基因均发生甲基化;而SW480细胞株中仅SFRPl和SFRP2出现启动子甲基化。SFRP蛋白表达水平与启动子甲基化呈明显负相关,使用5-氮杂-2'-脱氧胞苷处理后能有效恢复SFRP蛋白表达。(2)与癌旁组织相比,结直肠癌组织中SFRP1和SFRP5mRNA表达水平分别在85％和80％的样本中下调;SFRP4在80％的样本中表达上调。Westernblot方法也验证了SFRP1和SFRP4蛋白的表达变化与其对应mRNA水平变化一致。此外,免疫组化检测发现癌组织、高级别上皮内瘤变及腺瘤中SFRP1和SFRP4蛋白的表达存在显著差异(P＜0.05)(3)SFRP4基因转染肠癌细胞株HCT116后引起该细胞株基因表达谱广泛的改变,这些差异表达主要涉及p38MAPK信号通路、TNF信号通路、细胞凋亡等信号分子。
　　 结论:(1)SFRP1、2、5甲基化可能与结直肠癌的发生有关,SFRPs基因甲基化与其表达失活密切相关。(2)结直肠肿瘤中SFRP1和SFRP4表达存在差异,提示SFRP4不同于SFRP1所发挥的抑癌作用,可能具有其他生物学作用。(3)SFRP4转染肠癌细胞后引起了一些重要信号转导通路上的分子改变,提示SFRP4可能与这些信号通路的调节有关。