大鼠肝移植急性排斥模型的建立及一些相关研究

摘要

虽然高效免疫抑制剂的应用明显提高了肝移植患者生存率,但急性排斥反应(Acute Rejection,AR)仍然是肝移植术后最严重的并发症之一,其发生率仍然高达40％～60％,因此急性排斥仍然是肝移植研究的重点之一。急性排斥是由受体效应细胞对供体的同种异体抗原识别后而产生的一个免疫过程,在此过程中同种异体抗原通过抗原呈递细胞的MHC-II类分子呈递给效应细胞,随者各种细胞因子分泌受体免疫系统激活。传统研究认为,Th1/Th2动态平衡和AR的预后相关,在肝移植和肾移植中Th1功能激活在AR发生前就被观察到,Th2细胞则被证实与移植物耐受相关。然而最近,随着一个新的细胞系Th17的发现及对iTreg细胞免疫作用研究的日益深入,Th17/iTreg平衡已成为Th1/Th2平衡在移植免疫中的作用的一个重要补充,然而迄今Th17和iTreg在移植免疫中的作用尚未完全阐明。新兴的蛋白组学,是对基因组所编码的所有蛋白质进行研究的学科。通过蛋白质组学使我们对肝移植急性排斥的发生、发展有了更详尽的理解,并能够通过发现特异的分子标志物来预测患者预后和治疗效果。基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱技术(matrixassisted laserdesorption,time of flight/time of flight,mass spectrometry,MALDI-TOF/TOF MS)和LTQ是蛋白质组学新兴运用的技术,已有众多的研究组利用该技术在患者体液中发现了能够早期诊断疾病的标志物;本课题研究希望通过研究在肝移植术后大鼠血清中寻找与急性排斥相关的分子标记物,并对具有潜在价值的标记进行调控。本研究分为三个部分：
　　 第一部分：LEWIS→BN大鼠肝移植急性排斥模型的建立。
　　 目的：建立近交系LEWIS→BN大鼠原位肝移植急性排斥模型,分析手术成功率的影响因素及该模型的稳定性,并总结该模型区别于常规使用的SD、Wistar等封闭群大鼠间原位肝移植的特点
　　 结果：⑴LEW→BN及BN→BN总共29对大鼠OLT成功率为74％,手术失败原因构成:肝上下腔静脉出血(4对);门静脉结构性错误(3对);急性肺部损伤,可能与乙醚过度吸入有关(2对);尸体解剖未发现明显死亡原因(1对)。⑵供受体体重差异对手术的影响可通过控制体重及调整手术技术改善,抗生素对术后生存有明显影响。⑶与封闭群大鼠肝移植比较,该模型具有自身特点即在排斥出现的时间、程度和结果转归上表现并非完全一致,然而所有受体均出现了排斥现象。
　　 第二部分：T-bet+、GATA-3+、RORγt+和FOXP3+细胞在大鼠肝移植术后动态变化的研究。
　　 目的：评估Th1,Th2,Th17和iTreg在肝移植急性排斥中的作用,我们使用近交系LEWIS大鼠做供体,BN大鼠做受体建立肝移植急性排斥模型,并应用Banff标准对AR急性分级,然后应用免疫组织化学方法检测Th1,Th2,Th17和iTreg特征性表达的核转录因子以评估相应的作用。
　　 结果：⑴BN→BN组未出现明显排斥现象,LEW→BN组出现不同程度的排斥,对照组、轻度排斥组、中度排斥组和重度排斥组各选取5例进行T-bet+、GATA-3+、RORγt+和FOXP3+细胞检测。⑵T-bet+、GATA-3+、RORγt+和FOXP3+细胞在同种异体移植物中的表达:与对照组相比,轻度排斥组、中度排斥组和重度排斥组中T-bet+细胞数和RORγt+细胞数显著升高(P值均＜0.009,双侧);轻度排斥组中GATA-3+细胞数无明显升高(P值=0.754,双侧),中度排斥组中明显升高(P值=0.028,双侧),重度排斥组显著升高(P值=0.009,双侧);轻度排斥组FOXP3+细胞数无明显升高(P值=0.347,双侧),中度、重度排斥组显著升高(P值均＜0.009,双侧)。⑶T-bet+、GATA-3+、RORγt+和FOXP3+细胞在受体脾脏中的表达。
　　 第三部分：大鼠肝移植急性排斥血清蛋白质组学研究。
　　 目的：筛选大鼠肝移植术后与急性排斥相关的血清差异蛋白,为进一步寻找与预后相关的生物标记物提供研究基础。并对有意义的靶蛋白进行干预,观察干预对大鼠肝移植急性排斥的影响。
　　 结果：⑴应用2D-DIGE技术发现,在对照组、轻度排斥组、中度排斥组和重度排斥组中,有35个生物标记表达差异有统计学意义(P＜0.01)。⑵MALDI-TOF-TOF MS对具有统计学差异的30个蛋白进行鉴定,16个点鉴定出,剩余14个点使用LTQ鉴定出:血液结合素(hemopexin,HPX)结合珠蛋白(haptoglobin,Hp)的前体Preprohaptoglobin、C3补体、C4补体、Alpha1-Macroglobul in Receptor Binding Domain、Mbll Mannose-binding protein等。⑶对筛选出的生物标记进行调控,观察其生物效应。
　　 结论：①LEW→BN组合大鼠肝移植是研究急性排斥的稳定模型。②T-bet+、GATA-3+、RORγt+和FOXP3+在大鼠肝移植急性排斥中起到重要作用。③筛选出的了一批可能与肝移植术急性排斥有关的血清差异蛋白。