人类白细胞抗原-G蛋白表达与肝细胞癌预后的关系

摘要

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC,简称肝癌)是全球常见的恶性肿瘤,在我国是恶性肿瘤的第二位死因。近年来西方国家的发病率也有上升的趋势,引起了广泛的重视。虽然手术提供了根治性治疗肝癌的机会,但高复发转移率仍然是影响预后的主要原因。研究肿瘤复发转移的机制正成为攻克肝癌的关键。
　　 最近肿瘤免疫微环境对复发转移的影响引起了研究者的重视。肿瘤局部的免疫状态受宿主和肿瘤两方面调控。就宿主而言,局部的免疫效应是由抗瘤和促瘤两方面因素综合决定,抗肿瘤免疫包括CD8+T细胞、自然杀伤(natural killer,NK)细胞、NK T细胞等;促肿瘤因子包括肿瘤相关因子和调节性细胞(T调节细胞为主,regulatory T cells,Tregs)等组成的免疫抑制网络。研究抗瘤和促瘤因素的平衡,对研究肿瘤的进展、更精确的分子分型、更准确的预后判断和个体化治疗方案的设计都至关重要。
　　 肿瘤可产生多种具有免疫调节作用的介质,影响其局部的免疫状态。其中,人类白细胞抗原-G(human1eukocyte antigen-G,HLA-G)是非经典型主要组织相容性复合物-Ⅰ类分子,最初被发现由母胎界面的滋养细胞表达,保护胎儿免受母体NK细胞的攻击。HLA-G蛋白有7种异构体,包括4种膜结合型蛋白(HLA-G1到G4),3种溶解型蛋白(HLA-G5到G7)。目前它被认为是一个肿瘤相关的免疫抑制分子,能抑制包括NK细胞、CD8+T。淋巴细胞、抗原递呈细胞等在内的固有免疫和过继免疫的许多构成部分。可以说,HLA-G是一个免疫抑制的全能分子。HLA-G蛋白在大肠癌、肺癌和胃癌中的过表达预示患者预后差。然而在预后预测方面仍然存在争议,甚至在同一种肿瘤内预示截然不同的预后结局,如胃癌、慢性B淋巴细胞性白血病等。而在肝癌中HLA-G的预后作用从未被阐述过。
　　 宿主和肿瘤之间存在不同层面、不同环节的相互作用。综合考虑宿主和肿瘤两方面因素,可能有助于理解宿主和肿瘤的相互作用,对于预测肿瘤预后亦将提供一个更全面的指标。本研究通过建立组织芯片,利用免疫组化染色检测173例肝癌组织内HLA-G蛋白、肿瘤浸润性Tregs和CD8+T细胞,同时研究了肿瘤内在免疫逃逸因素(HLA-G)和外在因素(Tregs/CD8+比值)与肝癌预后的关系,并将两者联合分析其与肝癌预后的关系。并利用Western blot法检测5种人肝癌细胞系中膜结合型HLA-G1蛋白表达。
　　 第一部分
　　 人类白细胞抗原-G蛋白表达与肝癌预后的关系
　　 本部分研究旨在探索HLA-G蛋白在肝癌内的表达与术后生存、复发转移以及临床病理特征的关系。在蛋白水平揭示HLA-G在肝癌中的临床相关性。
　　 随机选取180例于2002年1月到2006年9月间在复旦大学附属中山医院肝外科首次行根治性手术切除的患者。通过建立组织芯片,利用免疫组化染色和对细胞染色的量化定量法,评价了HLA-G在癌内的表达情况与肝癌患者术后生存、复发以及临床病理特征的相关性。在5种人肝癌细胞系中,运用Western blot检测膜结合型HLA-G1蛋白的表达。
　　 结果发现:单因素生存分析显示,HLA-G高表达的患者总生存(overallsurvival,OS)较HLA-G低表达组显著缩短(P=0.024),HLA-G的表达与肿瘤复发时间(time to recurrence,TTR)趋向负相关(P=0.070)。在BCLC早期患者中,HLA-G对预后的负作用更明显,OS与TTR的P值分别为0.012,0.038。多因素生存分析显示,HLA-G表达是OS的独立预后因素(HR,1.987;9596CI,1.241-3.180;P=0.004)。在BCLC早期病人中,HLA-G表达是OS(HR,3.145;95％CI,1.051-9.418;P=0.041)与FTR(HR,3.208:95％CI,1.176-8.750:P=0.023)的独立预后因素。膜结合型HLA-G1蛋白在人肝癌细胞系中的表达与细胞系的侵袭转移潜能一致,但是体内HLA-G蛋白表达与临床病理特征并无相关性。
　　 结论:HLA-G是肝癌患者术后的一个预后指标,尤其是在早期病人中,对细化早期病人的预后有价值。HLA-G蛋白的表达可能并不直接增强肿瘤的侵袭性。
　　 第二部分
　　 肿瘤浸润性T调节细胞与CD8+细胞比值与肝癌预后的关系
　　 本部分研究旨在分析肿瘤浸润性Tregs、CD8+细胞以及两者比值与肝癌生存、复发之间关系,并比较三者的预测效能,得出其中最优指标进一步探索其在临床不同分期肿瘤中的预测效力及其与临床病理特征之间的关系。
　　 对第一部分构建的组织芯片,进行免疫组化染色,计数Tregs与CD8+细胞的数量,进行生存分析。
　　 结果发现:生存分析提示,Tregs、CD8+细胞以及Tregs/CD8+比值都是OS和TTR的独立预后因素,高Tregs,低CD8+细胞和高比值均预示患者预后较差。三者之中,Tregs/CD8+比值对于预后的预测更为全面。在根据疾病分期的分层生存分析中,Tregs/CD8+比值在BCLC各期中的预后作用以晚期较为显著,是BCLC晚期病人OS(P=0.017)和TTR(P=0.003)的独立预后因素。对于早中期病人,Tregs/CD8+比值仅是早期OS的独立预后因素(P=0.007)。另外,Tregs/CD8+比值与肿瘤大小(P=0.012)、癌栓(P=0.002)、术前AFP水平(P=0.003)、BCLC分期(P=0.001)显著相关。
　　 结论：Tregs、CD8+细胞和Tregs/CD8+比值都是肝癌的独立预后指标,其中Tregs/CD8+比值为较为综合的指标。Tregs/CD8+比值对于预测BCLC晚期病人的预后更为有效。Tregs/CD8+比值与肝癌的生物学行为有关。
　　 第三部分
　　 联合分析人类白细胞抗原-G蛋白与Tregs/CD8+比值与肝癌预后的关系
　　 本部分旨在探索肿瘤内在免疫逃逸因素(HLA-G)与外在微环境免疫因素(Tregs/CD8+比值)之间联系,并将两个变量联合,分析其与肝癌预后的关系。
　　 结果Tregs/CD8+比值与HLA-G表达有统计学相关性(P=0.012,r=0.190),HLA-G高表达的患者Tregs/CD8+比值也较高,HLA-G表达高低组的Tregs/CD8+比值存在显著差异(P=0.013)。将HLA-G与Tregs/CD8+比值联合分组后(分3组:均低组、高/低混合组、均高组),与均低组相比,均高组的OS和TTR均显著缩短(P值均＜0.001),相对风险比都大于3倍以上。接受者操作特性曲线分析(ROC分析)提示联合分组对预后的预测效能高于单一变量。
　　 结论HLA-G与Tregs/CD8+比值有正相关性,说明HLA-G可能参与了局部免疫抑制或效应细胞的调控。联合HLA-G与Tregs/CD8+比值能更准确地预测肝癌预后。上述发现提示,综合考虑肿瘤内在免疫因素和外在免疫因素(宿主)能更精准的预测预后,并提供了一种针对肿瘤和间质联合治疗的免疫治疗策略。应用价值:提供了预测肝癌预后的新指标及研究思路,并提示了针对肿瘤和间质联合治疗的免疫治疗策略。
　　 创新点:首次在肝癌中阐述了HLA-G的预后价值。