上海地区甲型流感病毒HA基因和抗原变异研究

摘要

流行性感冒(简称流感)是由流感病毒引起的具有高度传染性的急性呼吸道传染病。由于流感病毒基因的高度变异性,造成人群的反复感染、发病率高、老年人和免疫力低下者更容易出现并发症导致死亡。每年世界上大约有20％的儿章和5％的成年人会感染流感,导致每年25～50万人因流感而死亡。本文对上海地区的流感进行监测并对病毒分离株HA基因及HA抗原的变异情况进行研究。
　　 主要包括以下内容:
　　 1、通过对2004～2009年上海地区流感的发病情况进行监测,结果表明除2004年夏秋季和2007年冬春季2个流行季节全为A/H3N2外,其他年度的季节性流感表现为A/H1N1、A/H3N2和/或乙型流感感染,但是不同的年份流感病毒型与亚型流行强度有所不同。乙型流感病毒在2005年冬春季和2006年冬春季季节性流感中活动强度较高,占阳性标本构成比分别为42.8％(24/56)和56.2％(9/16);2006年夏季和2007年冬春季的季节性流感中未分离到;2008年比较活跃,占阳性标本构成比为34.5％(48/139);但是2008年夏季未分离到;2009年冬春季仅分离到2株,占阳性标本构成比2.3％(2/88)。A/H1N1在2005～2006年3个流行季节活跃,占阳性标本构成比分别达到21.4％(12/56)、43.7％(7/16)、76.4％(26/34);在2007年冬春季和2008年冬春季分离株明显减少,占阳性标本构成比仅分别为0％(0/44)和5.0％(7/139);但是从2008年7月份开始活动性明显增强,在2008年夏季和2009年冬春季占阳性标本的构成比分别达到87.4％(152/174)和60.2％(53/88)。A/H3N2是近几年季节性流感的主要亚型,占阳性标本构成比为46.1％(257/557);2004年夏秋季和2005年夏秋季比较活跃,占阳性标本构成比分别为100.0％(6/6)和35.7％(20/56);但2006年冬春季和夏季流行强度低,占阳性标本构成比分别为0％(0/16)和23.5％(8/34);2007年和2008年冬春季又恢复活跃状态,占阳性标本构成比分别为100.0％(44/44)和61.2％(85/139);2008年夏季活动减弱,占阳性标本构成比为12.6％(22/174);在2009年流行强度又有所增强,阳性标本构成比达到37.5％(33/88)。
　　 上海地区2008年冬春季流感的流行高峰在3～4月份之间,较常年推迟一个月,夏季7～8月份出现第二个流行高峰,且流行强度高于冬春季的流行高峰,这与常年的的流感的流行情况有所不同。在流感亚型构成上,2008年冬春季主要为A/H3N2(阳性标本构成比61.2％),在中后期才陆续分离到A/H1N1流感毒株(阳性标本构成比5.0％),而夏季则以A/H1N1占绝对优势(阳性标本构成比87.4％),A/H3N2分离株明显下降(阳性标本构成比12.6％)。同一年中,季节性流感出现亚型转换,除了与人群免疫保护有关以外,还可能与病毒毒力增强有关,我们在冬春季12周分离到一例呼吸道A/H1N1、A/H3N2共感染患者,A/H1N1复制能力强于A/H3N2。
　　 2009年春季的流感监测结果显示,流感流行高峰位于第6周,比2008年提前一个月,与常年保持一致。流感病毒亚型构成情况与2008年夏季类似,仍以A/H1N1占优势(阳性标本构成比60.2％),但是A/H3N2流感毒株的比例有所增加(阳性标本构成比37.5％)。
　　 2、了解上海地区甲型流感病毒基因进化,在对流感病毒病原学监测基础上对甲型流感病毒分离株HA基因进行全序列测序分析,并与WHO疫苗推荐株进行比较。2005～2009年,A/H1N1流感病毒HA基因是由同一主干发展而来,相同年份序列相近,成簇分布;不同年份之间侧枝较长,表明序列变异较大。与A/NewCaledonia/20/1999(H1N1)(2000～2007年的疫苗推荐株)、A/SolomonIslands/3/2006(H1N1)(2007～2008年的疫苗推荐株)相比,A/Brisbane/59/2007(H1N1)(2008～2010年的疫苗推荐株)的侧枝长度最短,表明A/Brisbane/59/2007(H1N1)对目前上海地区人群流感流行的保护性较好。2008年夏季(7月～9月)的流行株序列和2008、2009年冬春季的流行株序列相差较远,而与2006年夏季流行株的序列较为接近,聚集在同一簇中,这也解释了流行株基因变异,导致2008年、2009年A/H1N1在人群流行原因。基因推断的氨基酸序列,R145K、R188M、A189T、1417V、S450N、N495S这些位点的变异只在2006年夏季与2008年夏季存在,其中R188M、A189T位于抗原决定区Sb。
　　 2004～2008年,A/H3N2流感病毒HA基因进化树具有以一个主干向上发展,侧枝很短的特征。进化树的主干很长,基本按照毒株出现的时间先后发展;但是侧枝很短,提示新旧毒株交替的速度很快。相同年份毒株序列相近聚集成簇,但同一年份的簇丛中常穿插有上一流行季节后期的部分流行株和下一流行季节前期的部分流行株。2004～2009年上海地区的流感病毒HA基因序列同样尝试向不同方向进化,而各种潜在的突变株在人群的免疫压力下与世界同期其他国家和地区相似,与WHO推荐的疫苗株序列相近。由于A/H3N2流感病毒感染人群的广泛性和不间断性,不同年份的新旧毒株序列之间相互穿插,与A/H1N1相比前后继承关系更为明显。2004～2009年A/H3N2流感病毒HA基因进化树中可以看出,A/Brisbane/10/2007(H3N2)作为2008～2009、2009～2010的疫苗推荐株,距离2008～2009流感流行株主干侧枝长度较短,表明其与大部分流行株序列相近,具有较好的保护作用。在2008年的流感监测中发现有一些突变位点较多的毒株,虽然突变位点大部分都位于非抗原决定区,并未达到新变种的要求条件,但是其会不会成为优势毒株,并对以后的流行造成影响尚需要进一步的观察监测。
　　 3、HA抗体是流感病毒的主要保护性抗体,而流感HA基因又是流感病毒变异速度最快的基因,所以HA抗原的不断变异,给流感疫苗的生产,选择和有效性带来很多问题。本文采用金黄地鼠作为动物模型,选取2005～2008年上海地区(包括上海、宁波、无锡等地区)散发和聚集性事件中的流行株,制备免疫血清,并进行交叉的HAI实验,研究甲型流感病毒HA的变异情况。病毒株自身HA抗体的血凝抑制实验HAI值在64～1024之间;同样以金黄地鼠作为动物模型所得HA抗体的血凝抑制实验中HAI值在16～256之间;而与以BALBc小鼠免疫数种流感疫苗,所得HAI值在8～128之间,免疫的金黄地鼠结果还是令人满意的。
　　 2005～2008年A/H3N2流感病毒的HA抗原分析结果显示,2005与2007年的流感病毒HA抗原发生了小的变异,而2007年与2008年的流感病毒间HA抗原似乎未发生明显变化。A/Sydney/5/1997(H3N2)由于距现在年代较远,HA抗原发生了较大变异,虽然属于同一亚型,但与2005～2008年的流感病毒间HA抗原的交叉反应已不明显,交叉保护作用微弱。A/Fujian/411/2002(H3N2)作为2004～2005年的疫苗推荐株与2005年的流行株之间HA抗原较为接近,具有一定的交叉保护作用;但与2007～2008年的流行株HA抗原间也发生了明显变异,交叉保护作用弱。A/Brisbane/10/2007(H3N2)作为2008～2010年疫苗推荐株,与2008年的流行株HA抗原相似,具有明显的交叉保护作用。
　　 2005～2008年A/H1N1流感病毒的HA抗原分析结果显示,2005与2006年的流感病毒流行株HA抗原性相似,而2008年的流感流行株与2005和2006年的流行株均发生有变异。A/Newcaledonia/20/1999(H1N1)作为在2000～2007年疫苗推荐株,与2005年的流行株之间HA的抗原性均相似,表明交叉保护作用较强;与2006年的流行株HA的抗原性开始有小的变异,表明2006年流行株与疫苗株之间已经存在一定的差异,交叉保护作用减弱;与2007～2008年的流行株HA抗原间也发生了明显变异,交叉保护作用明显减弱。2008年夏季流感主要是A/H1N1流行。A/Brisbane/59/2007(H1N1)-like作为2008～2010年的疫苗推荐株,与2008年冬春季的流行株抗原性相似,交叉保护作用显著;与2008年夏季的个别毒株有小的变异,交叉保护作用减弱。