分娩性臂丛损伤垂腕垂指畸形发生机制的实验研究

摘要

本研究分为三部分：
　　 第一部分、模拟产瘫和成人臂丛根性损伤发生垂腕垂指畸形的大鼠模型建立
　　 目的：建立产瘫和成人臂丛根性损伤出现垂腕垂指畸形的大鼠模型。
　　 方法：取雄性SD大鼠72只，其中出生后7天(P7)、14天(P14)和成年(大于3月龄)各24只，组成上述3个年龄组。每个年龄组大鼠按神经根处理方式等分成3个亚组，即：切断右侧C56神经根、C567神经根和C5678神经根。
　　 各组于术后3个月分别行如下检测以比较不同臂丛根性损伤对各年龄大鼠桡神经麻痹程度的差异：1)行为学评估：以腕关节背伸小于0°为垂腕标准，比较各组大鼠垂腕垂指发生率；2)桡神经电生理检测：观察前臂伸肌群CMAP潜伏期延迟率(latency delayed rate，LDR)及波幅恢复率(amplitude recovery rate，ARR)的变化，比较桡神经病变程度；3)前臂伸肌组织学检测：测量桡侧腕伸肌和指总伸肌湿重，HE染色后测量肌细胞横截面积，观察肌湿重维持率(muscleweight maintaining rate，MWMR)和肌细胞截面积恢复率(cross-sectional arearecovery rate，CSARR)的变化，比较前臂伸肌萎缩程度。Von Geison染色观察肌肉组织胶原纤维含量的变化，比较纤维化程度；4)桡神经组织学检测：取上臂中段桡神经主干行甲苯胺蓝半薄切片染色观察有髓神经纤维的形态及数目，比较再生有髓神经纤维的通过率(regenerated nerve traversing rate，NTR)：5)分子生物学检测：Real-time PCR及Western-blot检测观察桡神经组织内神经丝蛋白200(NF200)和外周髓鞘蛋白0(PO)的mRNA和蛋白表达水平的变化，比较桡神经有髓神经纤维的成熟度。
　　 各组垂腕垂指发生率用Fisher精确概率法比较。其余数据进行正态性检验，满足正态分布者以均数±标准差表示，资料呈偏态分布时则以中位数(25百分位数～75百分位数)表示。对正态分布且满足方差齐性的资料行方差分析，未满足上述条件的数据采用秩和检验进行两两比较，以P<0.05为显著性检验标准，Bonferroni法控制检验水平。数据采用SPSS11.5统计软件进行分析。
　　 结果：1)行为学观察：C56神经根切断后，各年龄组大鼠实验侧均无垂腕垂指畸形。C567切断后，成年组8只大鼠中仅有1例而P7和P14组分别为7例和6例发生垂腕垂指。成年组垂腕垂指畸形发生率低于P7组(P<0.05)和P14组(P>0.05)，差异均有统计学意义。P7组和P14组之间差异无统计学意义(P>0.05)。C5678切断后，各年龄组大鼠每例实验侧均出现垂腕垂指畸形。
　　 2)桡神经电生理检测：C56神经根切断后，各年龄组桡侧腕伸肌和指总伸肌所有电生理指标总体比较的差异无统计学意义(P值均大于0.05)。C567神经根切断后，各年龄组桡侧腕伸肌及指总伸肌CMAP潜伏期延迟率总体比较的差异无统计学意义(P值均大于0.05)。成年组桡侧腕伸肌和指总伸肌CMAP波幅恢复率高于P7组(P值均小于0.05)和P14组(P值均小于0.05)，P7组和P14组比较的差异无统计学意义(P值均大于0.05)。C5678神经根切断后，各年龄组桡侧腕伸肌和指总伸肌所有电生理指标总体比较的差异无统计学意义(P值均大于0.05)
　　 3)前臂伸肌群组织学检测：C56神经根切断后，各年龄组桡侧腕伸肌和指总伸肌肌湿重维持率、肌细胞截面积恢复率及胶原纤维累积光密度比值总体比较的差异均无统计学意义(P值均大于0.05)。C567神经根切断后，成年组桡侧腕伸肌和指总伸肌肌湿重维持率高于P7组(P值均小于0.05)和P14组(P值均小于0.05)，P7组和P14组差异无统计学意义(P值均大于0.05)。成年组桡侧腕伸肌和指总伸肌肌细胞截面积恢复率高于P7组(P值均小于0.05)和P14组(P值均小于0.05)，P7组和P14组差异无统计学意义(P值均大于0.05)。成年组桡侧腕伸肌和指总伸肌胶原纤维累积光密度比值均低于P7组和P14组(P值均小于0.05)，P7组和P14组差异无统计学意义(P值均大于0.05)。C5678损伤术后，各年龄组桡侧腕伸肌和指总伸肌肌湿重维持率、肌细胞截面积恢复率及胶原纤维累积光密度比值总体比较的差异均无统计学意义(P值均大于0.05)。
　　 4)桡神经组织学检测：C56神经根切断后，各年龄组桡神经再生有髓神经纤维的通过率总体比较的差异无统计学意义(P值均大于0.05)。C567神经根切断后，成年组桡神经再生有髓神经纤维的通过率高于P7组和P14组(P值均小于0.05)，P7组和P14组差异无统计学意义(P值均大于0.05)。C5678神经根切断后，各年龄组桡神经再生有髓神经纤维的通过率总体比较的差异无统计学意义(P值均大于0.05)。
　　 5)分子生物学检测：C56神经根切断后，各年龄组测得NF200和P0蛋白的mRNA相对表达量及蛋白含量总体比较的差异均无统计学意义(P值均大于0.05)。C567神经根切断后，成年组NF200和P0蛋白的mRNA相对表达量及蛋白含量均高于P7组(P值均小于0.05)和P14组(P值均小于0.05)，P7组和P14组差异无统计学意义(P值均大于0.05)。C5678神经根切断后，各年龄组测得NF200和P0蛋白的mRNA相对表达量及蛋白含量总体比较的差异均无统计学意义(P值均大于0.05)。
　　 结论：上述实验结果显示：C56神经根切断后幼年和成年大鼠伸腕伸指功能均无明显损害；C567神经根切断后幼年大鼠伸腕伸指功能损害明显加重，成年大鼠损伤程度较轻而不足以引起明显伸腕伸指功能障碍。C5678神经根切断后，所有检测指标均表明不论幼年大鼠还是成年大鼠伸腕伸指功能均严重受损。
　　 本实验证明幼年及成年大鼠臂丛根性损伤造成垂腕垂指畸形的规律与人类相似，因此大鼠是进行产瘫与成人臂丛根性损伤垂腕垂指畸形发生机制研究的理想动物。
　　 第二部分、不同年龄大鼠臂丛根性损伤导致垂腕垂指畸形发生机制的实验研究
　　 目的：通过逆行示踪技术测定大鼠桡神经相应脊髓前角细胞的数量和形态，比较新生及成年大鼠桡神经运动成分的神经根支配百分比，以及随年龄增长的变化规律，阐明幼年和成年大鼠臂丛根性损伤导致垂腕垂指畸形的发生机制。
　　 方法：取雄性SD大鼠24只，其中出生后7天(P7)、14天(P14)和成年(大于2月龄)大鼠各8只，组成上述3个年龄组。以5％霍乱毒素亚单位B(cholera toxin Bsubmit，CTB)为示踪剂，经桡神经逆行标记C5678T1节段脊髓前角运动神经元后作30μm连续冰冻切片，漂片法免疫荧光显色后用Abercrombie公式校正计数，观察臂丛上(C56)、中(C7)、下干(C8T1)脊髓节段标记的前角细胞在所有标记神经元中所占百分比随年龄增长的变化规律。所有数据进行正态性检验，满足正态分布者以均数±标准差表示，资料呈偏态分布时则以中位数(25百分位数-75百分位数)表示。对正态分布且满足方差齐性的资料行方差分析，未满足上述条件的数据采用秩和检验进行两两比较，以P<0.05为显著性检验标准，Bonferroni法控制检验水平。数据采用SPSS11.5统计软件进行分析。
　　 结果：比较标记细胞绝对计数：P7组大鼠标记神经元数目为326.3±36.9；P14组大鼠为212.8±20.6；成年大鼠为140.4±19.5，三者之间两两比较，差异均有统计学意义(P7和P14组比较P<0.0001；P7和成年组比较P<0.0001；P成年组和P14组比较P<0.0001)。
　　 在C5和C6节段，P7组标记神经元所占比例为34.2%、P14组为31.3%、成年组为24.8%。三组数据总体比较差异有统计学意义(P<0.05)。各年龄组C56节段细胞计数百分比值两两比较：P7组高于成年组(P<0.05)；P14组高于成年组(P<0.05)；P7组和P14组差异无统计学意义(P<0.05)。
　　 在C7节段，P7组标记神经元所占比例为28.4%、P14组为25.3%、成年组为22.5%。三组数据总体比较差异有统计学意义(P<0.05)。P7组高于成年组(P<0.05)；P14组和成年组差异无统计学意义(P<0.05)；P7组和P14组差异无统计学意义(P<0.05)。
　　 在C8和T1节段，P7组标记神经元所占比例为37.5%、P14组为44.7%、成年组为50.7%。三组数据总体比较差异有统计学意义(P<0.05)。各年龄组C8T1节段细胞计数百分比值两两比较：P7组低于成年组(P<0.05)；P14组低于成年组(P<0.05)；P7组和P14组差异无统计学意义(P<0.05)。
　　 结论：臂丛上、中、下干对大鼠桡神经运动成分的支配权重随着年龄变化有“重心下移”的趋势，即在幼年大鼠桡神经运动成分较多来源于上、中干，而下干支配比率相对较小。随着年龄增长下干支配比例逐渐升高，最终导致来源于上、中干及来源于下干的桡神经支配权重接近。神经发育过程中，脊髓各节段之间支配桡神经的运动神经元分布比例的动态改变可能是造成大鼠臂丛上、中干损伤后幼年较成年个体更容易出现垂腕垂指畸形的主要原因。
　　 第三部分、不同神经重建手术对各年龄段大鼠臂丛根性损伤垂腕垂指畸形疗效的比较研究
　　 目的：观察不同神经重建手术对新生大鼠和成年大鼠臂丛上、中干损伤垂腕垂指畸形疗效的影响，为临床上手术方式选择提供理论依据。
　　 方法：取雄性SD大鼠48只，其中出生后7天(P7)和成年(出生后90-100天，体重200-250g)大鼠各24只，组成上述2个年龄组。切断左侧臂丛上、中干后立即行不同修复术，每组按手术方式等分为3个亚组：A)神经移植修复上、中干；B)神经移植修复上千，中干不予修复，远端反折缝合于邻近肌肉；C)上、中干不予修复，远端反折缝合于邻近肌肉。
　　 各亚组于术后3月分别行如下检测分别比较不同术式对各年龄组前臂伸腕伸指功能改善情况：1)行为学评估：以腕关节背伸小于0°为垂腕标准，比较各组大鼠垂腕垂指发生率；2)桡神经电生理检测：观察前臂伸肌群CMAP潜伏期延迟率(latency delayed rate，LDR)及波幅恢复率(amplitude recovery rate，ARR)的变化，比较桡神经传导性能及前臂伸肌兴奋性；3)前臂伸肌组织学检测：测量桡侧腕伸肌和指总伸肌湿重，HE染色后测量肌细胞横截面积，观察肌湿重维持率(muscle weight maintaining rate，MWMR)和肌细胞截面积恢复率(cross-sectional area recovery rate，CSARR)的变化，比较前臂伸肌萎缩程度。4)桡神经组织学检测：取桡神经行甲苯胺蓝半薄切片染色观察有髓神经纤维的形态及数目，比较再生有髓神经纤维的通过率(regenerated nerve traversing rate，NTR)；5)分子生物学检测：Real-time PCR及Western-blot检测观察桡神经组织内神经丝蛋白200(NF200)和外周髓鞘蛋白0(P0)的mRNA和蛋白表达水平的变化，比较有髓神经纤维的成熟度。统计方法同第一部分。
　　 结果：1)行为学观察：幼年和成年大鼠A组均无垂腕垂指；幼年B组大鼠垂腕垂指发生率高于成年B组(P<0.05)；幼年C组垂腕垂指发生率高于成年C组(P<0.05)。幼年大鼠A组垂腕垂指少于幼年B组(P<0.05)和C组(P<0.05)，B、C两组间差异无统计学意义(P>0.05)；成年大鼠A、B两组间垂腕垂指发生率差异无统计学意义(P>0.05)，但均少于C组(P<0.05)。
　　 2)桡神经电生理检测：幼年各组比较，桡侧腕伸肌及指总伸肌CMAP潜伏期延迟率总体比较的差异均无统计学意义(P值均大于0.05)；A、B、C三组桡侧腕伸肌及指总伸肌CMAP波幅恢复率均依次降低，两两比较均差异有统计学意义(P值均小于0.05)。成年各组比较，A、B、C三组桡侧腕伸肌及指总伸肌CMAP潜伏期延迟率总体比较的差异均无统计学意义(P值均大于0.05)。A、B两组桡侧腕伸肌及指总伸肌CMAP波幅恢复率差异均无统计学意义(P值均大于0.05)，但均高于C组(P值均小于0.05)。
　　 3)前臂伸肌群组织学检测：幼年A、B、C组桡侧腕伸肌和指总伸肌肌湿重维持率依次降低，两两比较的差异均有统计学意义(P值均小于0.05)。肌细胞截面积恢复率依次降低，两两比较的差异均有统计学意义(P值均小于0.05)。成年A、B两组桡侧腕伸肌和指总伸肌肌湿重维持率的差异无统计学意义(P值均大于0.05)，但均高于C组(P值均小于0.05)。A、B两组桡侧腕伸肌和指总伸肌肌细胞截面积恢复率的差异无统计学意义(P值均大于0.05)，但均高于C组(P值均小于0.05)。
　　 4)桡神经组织学检测：幼年A、B、C三组再生有髓神经纤维的通过率依次减小，两两比较的差异均有统计学意义(P值均小于0.05)。成年A、B两组间再生有髓神经纤维通过率的差异无统计学意义(P值均大于0.05)，但均高于C组(P值均小于0.05)。
　　 5)分子生物学检测：幼年A、B、C三组MyoD1和Myogenin的mRNA相对含量均依次升高，两两比较的差异均有统计学意义(P值均小于0.05)。成年A、B组MyoD1和Myogenin的mRNA相对含量的差异无统计学意义(P值均大于0.05)，但均高于C组(P值均小于0.05)。幼年A、B、C三组MyoD1和Myogenin与B-actin的吸光度比值均依次升高，两两比较的差异均有统计学意义(P值均小于0.05)。成年A、B组MyoD1和Myogenin与β-actin的吸光度比值的差异无统计学意义(P值均大于0.05)，但均高于C组(P值均小于0.05)。
　　 结论：成年大鼠单纯修复上干和修复上、中干对伸腕伸指功能的疗效无明显差别。幼年大鼠臂丛上、中干损伤后单纯修复上千对伸腕伸指功能无明显改善，而修复上、中干后其恢复良好。因此，临床上对产瘫C567臂丛根性损伤应注重对C7神经根的修复。