维甲酸诱导脊膜膨出胎鼠神经损害的观察和手术修补实验

摘要

脊髓脊膜膨出等神经管缺陷是导致小儿神经原性膀胱功能障碍的最主要的病因，可致截瘫、大小便失禁、脑积水、性功能障碍、骨骼畸形和精神损害等严重后果。胎儿外科手术可能是早期干预脊髓脊膜膨出的较好方法，但对于手术效果等还有待利用动物模型等进一步的研究；另外，脊髓脊膜膨出后脊髓损伤，导致膀胱神经和肌肉的改变，其相关神经损害及相互关系目前还未完全明确，需要进一步的研究。以往的脊髓脊膜膨出动物模型多为手术造模或基因突变系动物，与人类的脊髓脊膜膨出的病理生理过程有较大的差异。维甲酸诱导SD孕鼠，产生脊髓脊膜膨出胎鼠，可能是一个较理想的动物模型。
　　 目的：本研究优化维甲酸灌喂孕SD大鼠诱导产生脊髓脊膜膨出胎鼠的动物模型，以得到较高的胎鼠脊髓脊膜膨出比率和较低的死胎比率，同时希望脊髓脊膜膨出胎鼠膨出范围较小。在此基础上通过对不同胚胎期MMC胎鼠膀胱平滑肌的发育和神经支配情况及脊髓神经损害的形态学观察，并且对一些脊髓损伤相关的细胞因子的mRNA进行RT-PCR检测，以期了解这种损害的时间和空间上的变化及其相互关系。同时利用这一模型，采用组织工程材料对胎鼠进行脊膜膨出修补实验，以探索胎内手术方法并了解胎内手术对改善膀胱神经支配可能的作用。
　　 材料与方法：
　　 1、维甲酸诱导脊髓脊膜膨出胎鼠动物模型的优化：按孕鼠灌喂时间分为3组：孕9天组(孕9天9a.m.左右灌喂维甲酸)，孕9.5天组(孕9天晚11p.m。左右灌喂维甲酸)，孕10天组(孕10天9a.m.左右灌喂维甲酸)。实验组：SD孕鼠灌喂全反式维甲酸，溶于2ml橄榄油中；对照组：SD孕鼠仅灌喂2ml橄榄油。灌喂剂量：孕9天组剂量从60-110mg/kg不等，分为若干小组；孕10天组剂量从40-120mg/kg不等，分为若干小组；孕9.5天组剂量分为80和100mg/kg两个小组。在胚胎16，18，20天(E16，E18，E20)分别剖腹产取出胎鼠，统计总孕鼠数、总胎鼠数、MMC胎鼠数、死胎/吸收胎数等数据。对实验组，计算MMC率(MMC胎鼠占所有胎鼠的比率)、死胎率(死胎/吸收胎占所有胎鼠的比率)和活胎MMC率(MMC胎鼠占所有活胎的比率)，数据用Stata7软件进行Pearsonx2检验，以P≤0.05为有显著性差异。
　　 2、不同胎龄脊髓脊膜膨出胎鼠膀胱和脊髓神经损害的形态学观察：胎鼠分为MMC组(灌喂维甲酸后产生MMC的胎鼠)和正常对照组(灌喂橄榄油后产生的正常胎鼠)，每组再根据胎龄各分3小组，即胚胎16天组(E16)，胚胎18天组(E18)，胚胎20天组(E20)，共6小组。取各组腰骶段脊髓切片，用免疫组织化学法检测脊髓的GFAP、VAChT的表达；取各组膀胱切片，检测α-Actin和neurotubulin-β-Ⅲ的表达；另取各组腰骶段脊髓及膀胱切片，作HE染色。Leica Qwin软件拍摄显微镜下照片，Image-Pro Plus5.1软件分析免疫组化照片相关部分的光密度，SPSS16.0软件对数据进行进行统计分析，以P≤0.05为有显著性差异。
　　 3、不同胎龄脊髓脊膜膨出胎鼠脊髓HGF等细胞因子的RT-PCR检测：胎鼠分为MMC组(灌喂维甲酸后产生MMC的胎鼠)和正常对照组(灌喂橄榄油后产生的正常胎鼠)，每组再根据胎龄各分3小组，即胚胎18天组(E18)，胚胎20天组(E20)，胚胎21天组(E21)，共6小组，每组胎鼠数量为5个。解剖显微镜下分离胎鼠标本脊柱，显微镊子拆除背侧脊椎，完整取出包括膨出部分的整根脊髓。立即抽提RNA，对肝细胞生长因子(HGF)及受体c-MET和纤溶酶原激活物tPA和uPA以及内参基因GAPDH进行反转录和PCR扩增。获得的数据采用PSS16.0软件进行统计分析，对分组资料(对照组和MMC组)采用power(2，-△ct)处理数据；多组间比较进行ANOVA检验分析，两组间检验采用t检验(以P值≤0.05为有统计学意义)。
　　 4、组织工程材料大鼠胎仔手术修补脊膜膨出：孕18天MMC大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉，剖腹切开子宫，暴露胎鼠脊膜膨出部位，采用壳聚糖-明胶薄膜以氰基丙烯酸酯粘合剂粘合于脊膜膨出部位，修补脊膜膨出。回纳胎鼠，修补子宫，关闭腹腔切口。孕鼠养至孕21天剖宫取出胎鼠。观察壳聚糖-明胶薄膜覆盖情况；取出脊髓连续切片，HE染色；膀胱免疫组化染色，与正常组对照，观测VACHT和neurotubulin-β-Ⅲ的表达，检测光密度并行t检验。
　　 结果：
　　 1、维甲酸诱导脊髓脊膜膨出胎鼠动物模型的优化：1.孕9天日间灌喂组按维甲酸灌喂剂量分为60、70、80和110mg/kg4个小组，共18只孕鼠，209只胎鼠。各剂量组所得到的MMC胎鼠率都非常低(0-1.92％)，死胎率却非常高(90.91％-100％)。2.孕10天灌喂组按维甲酸灌喂剂量分为40、50、60、70、80、85、90、100和120rag/kg9个小组，共56只孕鼠，564只胎鼠。剂量为120mg/kg时，胎鼠MMC率最高，为29.95％，活胎MMC率也最高，为38.99％，而死胎率相对较低(23.19％)。3.孕9.5天灌喂组按维甲酸灌喂剂量分为80和100mg/kg2个小组，共41只孕鼠，423只胎鼠。两组MMC率分别为31.66％和29.41％，没有统计学差异；活胎MMC率分别为44.21％和55.56％，也没有统计学差异；而死胎率80mg/kg组为28.40％，显著低于100mg/kg组的47.06％(P=0.001)。此外，在80mg/kg组，有一些MMC膨出的范围较小的胎鼠。
　　 2、不同胎龄脊髓脊膜膨出胎鼠膀胱和脊髓神经损害的形态学观察：1.在胚胎16天，2组胎鼠的膀胱肌层内就已经可以检测出neumtubulin-β-Ⅲ的表达；胚胎16、18和20天时，MMC组胎鼠膀胱内的neurotubulin-β-Ⅲ表达较相同胚胎期的正常对照组显著降低。2.在胚胎16、18、20天，2组的膀胱肌层内都能看到较多的α-Actin的阳性显色；且各胚胎期，2组膀胱内的(α-Actin表达无显著性差异。3.在胚胎16天和18天，正常组和MMC组及胚胎20天正常组的脊髓内，GFAP染色均很少，没有明显的星形胶质细胞显示，在胚胎20天的MMC组胎鼠的脊髓背侧，可见大量的GFAP阳性的星形胶质细胞显影，其表达显著高于正常组。4.MMC组各个胚胎期脊髓VAChT的表达都较少，在胚胎20天组的背外侧核仅见少量阳性表达的神经元；而正常组VAChT的表达相对较多，在胚胎20天组的背外侧核可见较多阳性表达的神经元；2组间各胚胎期VAChT表达差异均有统计学意义。
　　 3、不同胎龄脊髓脊膜膨出胎鼠脊髓HGF等细胞因子的RT-PCR检测：1.c-M盯在MMC组较对照组随胚胎时间增加其表达有增高趋势，在胚胎21天MMC组较对照组表达升高比18天差异有显著性。2.c-MET的配体HGF的表达MMC组也随胚胎时间增加有增高趋势，在胚胎21天MMC组较对照组表达升高比18和20天差异均有显著性。3.tPA对照组和MMC组表达无统计学差异，但MMC组均高于对照组。4.uPA在MMC组较对照组随胚胎时间增加其表达有增高趋势，在E21天MMC组较对照组表达升高比E18和E20组差异均有显著性。
　　 4、组织工程材料大鼠胎仔手术修补脊膜膨出：1-共进行孕鼠手术85只，麻醉死亡孕鼠10只，成功诱导出脊髓脊膜膨出的孕鼠31只。每只孕鼠仅取1个胎鼠手术，20只胎鼠顺利完成手术修补操作过程，11只手术失败主要为胎鼠溢出子宫，胎盘剥离。20只行脊膜膨出修补手术完成的胎鼠中7只存活但2只壳聚糖-明胶薄膜脱落。5只修补成功，成功率15.1％(占手术修补的31只比例)。另13只死亡，死亡率65％。修补脊髓脊膜膨出的胎鼠在孕21天HE染色可以观察到壳聚糖-明胶薄膜下有皮肤样细胞长入。膀胱免疫组化染色显示neurotubulin-β-Ⅲ表达手术组与正常对照组无差异，与MMC组比较差异有显著性；VACHT检测，脊膜膨出修补组与MMC组比较差异无显著性。
　　 结论：
　　 1、在本实验室，孕10天120mg/kg灌喂组、孕9.5天80mg/kg和孕9.5天100mg/kg灌喂组均能取得约30％的MMC率，死胎率前两者显著低于后者。孕9.5天80mg/kg灌喂组制模所得胎鼠伴发其他严重畸形相对较少，与临床病例表现更为接近，可能更适合用于胎儿外科等研究，是较为理想的制模条件。
　　 2、MMC胎鼠胚胎16天至20天膀胱肌层内可见神经支配，但神经纤维减少，这与脊髓内骶副交感神经核和背外侧核的胆碱能神经元减少是同步的，这两个区域分别是支配膀胱逼尿肌的盆神经和支配尿道外括约肌阴部神经的节前神经元分布的区域。MMC胎鼠膀胱平滑肌的分化和发育与正常组相比无显著差别。
　　 3、MMC胎鼠脊髓损伤后的神经修复过程，星形胶质细胞的出现晚于胚胎18天；在胚胎20天，脊髓的背侧(即MMC突起于羊膜腔的一侧)出现大量的星形胶质细胞。
　　 4、MMC胎鼠脊髓的HGF及其受体c-MET的RT-PCR检测提示，HGF及c-MET的表达在胚胎晚期(E21)比早期(E18天)，MMC组较对照组表达升高的差异有显著性。这一结果提示HGF和c-MET的表达在MMC组随胚胎时间增加有增高趋势。
　　 5、MMC胎鼠脊髓的tPA及uPA的RT-PCR检测提示，uPA的表达在胚胎晚期(E21)比早期(E18天，E20)，MMC组较对照组表达升高的差异有显著性，而tPA的表达两组无明显差异。这一结果提示uPA的表达在MMC组随胚胎时间增加有增高趋势。
　　 6、胎鼠脊髓脊膜膨出可以采用组织工程材料壳聚糖一明胶薄膜在胎内进行修补。孕18天修补脊髓脊膜膨出的胎鼠在孕21天HE染色可以观察到壳聚糖-明胶薄膜下有皮肤样细胞长入。膀胱免疫组化染色显示neurotubulin-β-Ⅲ表达，手术组与正常对照组无差异，与MMC组比较差异有显著性，提示胎鼠手术可以阻止脊髓脊膜膨出中胎内二次打击造成的神经损伤过程，改善膀胱的神经支配。