介导NO信号转导的人可溶性鸟苷酸环化酶的表达纯化及其结构与性质研究

摘要

一氧化氮(NO)于1992年被美国Science杂志评选为明星分子。1998年，美国的三位科学家(Furchgott RF，Ignarro LJ和Murad F)因发现“NO是心血管系统中一种重要的信号转导分子”而荣获了诺贝尔生理和医学奖。至此以后，NO信号转导越发受到人们的密切关注。可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)是介导NO信号转导通路中的一个核心金属蛋白，扮演着NO受体这一重要角色。NO结合到sGC后将激活sGC催化其底物GTP转化为cGMP。cGMP是我们所熟知的一个重要的二级信使分子，通过对其效应蛋白的调节进而在多种生理过程中起着重要的作用，例如促进血管和平滑肌舒张；抑制血小板凝聚、血管重塑、细胞凋亡和炎症发生以及参与神经传递等等。一旦NO信号转导通路异常，将会导致多种疾病的发生，如多种心血管疾病(如肺动脉高血压、心力衰竭、动脉粥样硬化和再狭窄等)及神经退行性疾病等。
　　 真核生物sGC是一个含b型血红素，由α和β亚基组成的异源二聚体蛋白，每个亚基分别有两种异构体形式(α1/α2和β1/β2)，其中以α1β1这种异源二聚体形式最为广泛，研究也最多。按照同源序列和结构功能的分析，α和β亚基都可以大致分为三大结构域，分别是N-端血红素结构域(属于H-NOX家族)、中间结构域(也有将其细分为Per/Arnt/Sim(PAS)-like结构域和螺旋卷曲(CC)结构域)和C-端催化结构域。其中血红素结构域是sGC研究的核心，因为它正是信号分子NO/CO等的调节结构域，信号小分子的调节机理研究对NO信号转导异常所引发的疾病诊断治疗及新药开发具有重要的指导意义，也是近年来化学生物学研究领域的热点。
　　 sGC的研究已历经三十多年，目前已有近5000篇文献报道。但是许多关键问题尚未彻底解决，一直存在争议。例如，血红素是sGC活性调节的一个重要的辅基，但是它的结合区域及方式备受争议；NO激活及失活机理也是众说纷纭，仍无定论；α和β亚基异源二聚关键作用部位及其作用机理也尚待解决；sGC的晶体结构更是鲜有报道。所有问题的一大源头就是能否获取足量的蛋白。这么多年来sGC蛋白多数都是通过组织提取或者昆虫细胞表达而得，但是这些方法蛋白的产量都不高，而且耗费高，可以满足对其活性的测定研究，但是在很大程度上它限制了sGC的深入研究，尤其是在分子水平上详细研究其结构-性质-反应关系。大肠杆菌一直都以高效率、低成本、高产量著称，因此能否在大肠杆菌中成功的表达纯化我们所需的sGC蛋白是该课题研究之初最大的挑战。
　　 本论文的核心内容是集中在对sGC血红素结构域的研究。首先我们对人sGC(hsGC)β1亚基的N-端血红素结构域片段和全长蛋白(hsGCβ195，hsGCβ384和hsGCβ619)进行了质粒构建及其在大肠杆菌中的表达与纯化研究，成功建立了一套hsGC蛋白的高效表达与纯化体系(产量约20 mg/L培养液)，解决了sGC研究中的第一大瓶颈问题，为之后的结构-性质-反应研究奠定了很好的基础。这一体系我们已经申请了专利。通过同源结构模拟及能量优化我们得到了hsGCβ195蛋白的结构模型。在血红素重组基础上，我们对含血红素的hsGC蛋白进行了紫外可见光谱、EPR谱、圆二色光谱、荧光光谱的性质研究，研究发现血红素结构域(hsGCβ195)可以作为一个很好的工具用以进行sGC血红素相关的性质研究。变温圆二色光谱结果表明hsGCβ195蛋白脱辅基和含血红素形式的转变中点温度分别是56±1℃和54±3℃，说明两种形式都具有较好的热稳定性。pH滴定实验结果显示酸滴定和碱滴定的滴定中点(pKa)值分别为5.7±0.2和9.3±0.1，说明hsGCβ195蛋白具有较好的碱稳定性，但是在酸性条件下血红素容易脱出，蛋白容易沉淀。hsGCβ195蛋白中只含有一个色氨酸(Trp22)，通过监测Trp22内源荧光光谱可以用来研究蛋白的构象变化。Trp22荧光结果显示：脱辅基hsGCβ195中Trp22处于比较疏水的环境，血红素重组后荧光最大发射波长(λmax)红移，荧光信号强度大幅度下降，说明蛋白的构象发生了较大的变化，尤其是还原态和NO结合态，荧光信号几乎完全淬灭。我们推测是血红素结合后引发第一个α螺旋(αA)构象变化，使得Glu10(位于αA螺旋上)与Trp22相对位置改变并淬灭荧光。1-苯胺基萘-8-磺酸(ANS)是一个常用的疏水荧光探针，ANS外源荧光光谱结果显示ANS可能会与血红素部分竞争结合sGC疏水腔。
　　 为了探讨血红素的结合区域及作用方式，我们成功构建并表达纯化了α1亚基血红素结构域(hsGCα259)蛋白，并首次探索了其在血红素结合、NO/CO结合上的性质特征。同源结构模拟及能量优化得到的hsGCα259同源结构显示该蛋白存在一个大的空腔，血红素重组结果显示血红素可以稳定结合到hsGCα259上，因此我们推测该空腔主要作用是用于血红素的结合。EPR谱进而证实α1和β1两个亚基在结合血红素的微环境上最大的区别在于β1亚基有一个近端轴向配体(His105)配位而α1亚基缺乏强的轴向配体。血红素转移及ANS外源荧光实验表明hsGCα259可能是通过强的疏水相互作用稳定结合血红素的。我们认为：在异源二聚sGC蛋白中，α1和β1亚基的N-端血红素结构域共同参与了血红素的结合，其中β1亚基提供一个轴向配体(His105)与血红素铁配位，而α1主要是以疏水相互作用稳定血红素的结合。我们进而研究了hsGCα259和hsGCβ195的CO和NO结合过程。在CO结合过程的稳态平衡滴定和动力学结果的基础上我们提出了一个可能的CO结合模型。NO解离过程的研究表明NO解离是一个复杂的过程，需要用二级反应进行拟合，可能是由于NO结合态具有“open”和“closed”两种构象，这两种构象在电子吸收光谱上没有区别，但是在活性调节上有所区分。曾经有报道推测hsGCα259蛋白的空腔是用于sGC激活剂(如YC-1)的结合，YC-1的结合会增加sGC对CO的亲和力。但是我们CO滴定的结果显示YC-1对CO结合没有影响，等温滴定量热(ITC)测定结果也表明YC-1与hsGCa259并没有强的相互作用。
　　 为了详细研究轴向配位(Fe-H105)的作用，我们构建了hsGCβ195H105G突变体蛋白并进行详细的性质表征。EPR谱证明该蛋白的确没有了强的轴向配位。Trp22内源荧光结果也显示：His105突变前后脱辅基蛋白的构象变化不大，但是血红素重组后的蛋白构象有明显的改变。血红素转移和血红素还原实验表明轴向配体(H105)对提高血红素亲和力的作用不大，但是它可以减缓血红素氧化丢失进而对蛋白起到一定的保护作用，这在生理过程中具有重要意义。基于氧化态及脱辅基sGC的药物设计(sGC激活剂，sGC activator)是心血管疾病治疗的另一思路。
　　 为了研究异源二聚对血红素结构域的结构-性质-反应的影响，我们通过添加linker的方式将α1和β1两个亚基血红素结构域连接起来，构建出了一个新的蛋白质(hsGCβ195-α259)并对其进行了详细的表征。圆二色光谱及Trp22内源荧光光谱结果都表明该蛋白与单个亚基相比发生了很大的构象变化，并具有很好的稳定性。血红素重组及EPR谱结果显示：hsGCβ195-α259能够稳定结合血红素，但是其结合方式与α1亚基相似，其序列中的His105并没有与血红素轴向配位。我们推测hsGCβ195-α259中血红素构象存在两种可能性：一是血红素主要还是结合在β195的疏水腔里，添加linker及α259后β195与α259相互作用使得蛋白构象发生一定的变化，血红素远离H105，从而无法配位；另一种方式是linker的添加使得血红素进入β195的入口受阻，血红素主要结合在α259的疏水空腔，血红素与H105距离较远而无法配位，但是血红素具体的结合方式还有待于进一步的实验验证或者晶体结构的解析。对CO结合和NO解离过程的研究表明：hsGCβ195-α259蛋白与单个亚基相比，CO亲和力增加了近一倍，NO解离速率加快了约一倍。除此之外，我们还将β195和α259同时构建到pETDuet-1载体中以实现两个亚基的共表达。Amylose和Ni-NTApull-down实验结果表明这两个亚基在体内的确存在相互作用。而分别表达纯化的β195和α259在体外混合后却不能发生相互作用形成异源二聚蛋白。这一结果一方面说明sGC的血红素结构域对异源二聚具有一定的贡献，同时也反映出sGC异源二聚可能是由体内信号调节完成的。
　　 最后，我们还对sGC血红素结构域在晶体学方面进行了初步研究。经过大量的结晶条件筛选及多次尝试，最终我们成功培养出了hsGCβ195-α259和hsGCβ195H105G-α259突变体的脱辅基及含血红素形式蛋白的多种晶体，并已经获得晶体衍射数据，结构的解析工作正在进行中。晶体结构的解析将为理解sGC的血红素结合方式、NO调节机理提供重要的结构基础。