新生大鼠脑发育过程中不同磷酸化MeCP2修饰体的时空表达特性及转录调控功能研究

摘要

甲基化CpG结合蛋白2(Methyl-CpG binding protein-2，MeCP2)作为DNA甲基化结合蛋白家族中的成员之一，在表观调控中枢神经系统的发育过程中起着极其重要的作用。X染色体上MeCP2基因突变会导致Rett综合征(Rett syndrome，RTT)，主要表现为婴儿（多为女性）出生早期发育正常，但在6-18月之后出现严重的认知下降、自闭行为、僵化运动及癫痫。早期研究发现，MeCP2能够与基因启动子上的甲基化CpG结合，通过募集转录抑制复合物或直接干扰转录因子与启动子的结合，抑制基因转录。进一步研究发现，MeCP2在神经元不同活化状态下可以发生各异的特异位点磷酸化，如Serine80(S80)，Serine421(S421)，这种磷酸化修饰通过调节MeCP2与靶基因启动子的结合与解离，使得MeCP2的转录调控功能在“开”“关”两个状态间即时切换，进而达到高效快速调控基因表达的作用。基于RTT发病特点及磷酸化修饰在MeCP2功能调节中的重要作用，本实验采用不同出生时间的新生大鼠为研究对象，对MeCP2的不同位点磷酸化修饰形式在大鼠脑发育过程中的表达变化、胞内定位、细胞分布及其转录调控功能进行了较为细致的研究。研究结果主要分为以下几方面:
　　1.在大鼠脑发育过程中，不同位点磷酸化MeCP2的表达量随发育进行发生显著变化
　　针对RTT发病时程特点，我们采用western blot方法，首先观察了皮层中不同丝氨酸位点磷酸化MeCP2在大鼠不同年龄点，即胚胎18天(Embryonic day18，E18)、出生后1天(Postnatal day1，P1)、7天、14天、30天的表达变化特点。结果显示，出生早期(P1)，非磷酸化MeCP2(non-phosphorylated MeCP2，npMeCP2)、丝氨酸80位点磷酸化（phosphorylated serine80，pS80）MeCP2、丝氨酸292位点磷酸化（phosphorylated serine292，pS292）MeCP2均仅有少量表达;随着发育进行，它们的表达量均逐步增加(P7，P14)。与之不同，丝氨酸421位点磷酸化（phosphorylated serine421，pS421）MeCP2在P1、P7、P14均有较高水平表达。值得注意的是，在P30时， pS421、pS292 MeCP2表达量急剧下降，而npMeCP2、pS80MeCP2表达则继续增加。此外，小脑的western blot结果同样显示，在P30时，pS292 MeCP2显著减少而npMeCP2明显增多。同时，免疫组织化学单标结果显示，MeCP2不同位点磷酸化修饰形式在皮层各层中、海马各区中以及小脑中也具有各自特异的、随发育进行而表达变化的特点。以上结果表明，在新生大鼠脑中，不同位点磷酸化MeCP2的表达随发育进行发生改变，提示MeCP2在大鼠脑的发育过程中可能具有一定的作用，并且其作用与其位点特异的磷酸化修饰具有一定的关系。
　　2.MeCP2的不同磷酸化形式具有各异的胞内定位特点:
　　有研究显示，不同丝氨酸位点的磷酸化修饰能够改变MeCP2与靶基因的结合。因此，为了明确这种结合能力的改变是否与其胞内分布有关，我们首先采用细胞核浆蛋白分离提取技术结合Western blot半定量方法，研究了四种不同丝氨酸位点磷酸化MeCP2的胞内定位情况。结果显示，pS421、pS292 MeCP2特异性地分布于细胞浆组分中，而npMeCP2及pS80 MeCP2则主要分布于细胞核组分中。免疫荧光共聚焦结果进一步证实，pS421、pS292MeCP2主要定位于核外周(DAPI)，而npMeCP2及pS80 MeCP2则几乎集中表达在核内。以上结果提示，不同位点的磷酸化修饰可能通过改变MeCP2的胞内定位来影响MeCP2的功能。
　　3.MeCP2的各种磷酸化形式主要表达在神经元中，但有少部分pS292表达于星形胶质细胞中:
　　为了明确MeCP2主要在脑内何种细胞中发挥作用，我们进行了不同位点磷酸化MeCP2与神经元(NeuN)及星形角质细胞(GFAP)标记物在皮层、海马及小脑的免疫荧光共聚焦扫描。结果显示，在皮层中，pS421、pS292MeCP2主要表达于神经元胞浆中，而npMeCP2及pS80MeCP2则大多表达在神经元胞核中。值得注意的是，部分星形胶质细胞中也可见pS292阳性染色;此外，pS292在神经突起上也有显著表达，提示其可能具有更为复杂的作用。另一方面，在海马DG区，npMeCP2及pS292MeCP2也主要表达在神经元中;但在出生14天时，也可观察到较多pS292阳性的星形胶质细胞，并在出生30天时，可见一些npMeCP2阳性的星形胶质细胞。同时，在小脑中，四种MeCP2磷酸化形式大多表达在浦肯野细胞层中，但出生30天时，npMeCP2和pS80MeCP2在分子层中出现大量阳性染色。以上结果表明，MeCP2及其不同磷酸化修饰形式主要分布在神经元中，提示其可能在脑内神经元的发育过程中发挥着极为重要的作用。
　　4.不同位点磷酸化的MeCP2能够与神经元标记基因启动子相结合
　　目前研究普遍认为，MeCP2能够与基因启动子上的甲基化DNA相结合来调节靶基因转录。鉴于MeCP2的不同磷酸化形式主要表达在神经元中，因此，为了验证npMeCP2及pS80、pS421、pS292 MeCP2与甲基化DNA的结合能力，我们采用染色质免疫共沉淀(ChIP)方法结合实时定量PCR技术(ChIP-qPCR)，检测了出生14、30天时皮层中四种MeCP2与dcx、map-2或gfap（对照）基因启动子的结合能力及变化情况。结果显示，在出生14、30天的皮层中，npMeCP2及pS292、pS421、pS80 MeCP2均能与dcx、map-2及gfap基因启动子相结合，且随发育进行，其结合能力均有不同程度的增强。值得注意的是，pS80 MeCP2的结合能力高于npMeCP2及pS292、pS421 MeCP2;而npMeCP2的结合能力在出生14天时与pS292、pS421MeCP2相近，但在出生30天时略高于后两者。以上结果提示，不同丝氨酸位点的磷酸化修饰可能影响了MeCP2与靶基因启动子的结合能力，进而影响其转录调控作用。
　　5.在大鼠脑发育过程中，MeCP2靶基因的转录及翻译量发生显著变化
　　为了明确发育过程中MeCP2靶基因的转录、翻译是否发生变化，我们采用RNA逆转录PCR方法结合实时定量PCR技术(RT-qPCR)，检测了大鼠出生后7、14、30天时皮层和小脑中dcx、tuj1、map-2及gfap基因的转录变化情况，同时应用western blot方法，观察了发育过程中神经细胞标记蛋白的表达变化情况。结果显示，在皮层和小脑中，dcx和tuj1的mRNA水平随发育进行显著下降，而map-2及gfap mRNA含量逐渐增多。同时，western blot的蛋白半定量结果显示了类似的变化特点。以上结果提示，在发育过程中，MeCP2靶基因的转录和翻译水平均发生了显著改变，提示MeCP2可能参与了其转录调控过程。
　　6.抑制内源性MeCP2表达能够影响神经细胞标记蛋白的表达
　　为了明确MeCP2是否参与了dcx、tuj1、map-2及gfap基因的转录调控过程，我们采用出生后7天大鼠延髓池注射MeCP2 shRNA质粒结合western blot半定量分析的方法，检测了脑发育至14、30天时小脑内神经元标记蛋白(DCX，Tuj1，MAP2)及GFAP的表达变化情况。结果显示，与对照组相比，出生14天时npMeCP2显著减少，同时，GFAP表达显著下降，而DCX，Tuj1，MAP2无明显变化。与之不同，出生30天时，npMeCP2含量无明显改变，但DCX和Tuj1含量显著减少， MAP2表达明显增加，而GFAP无明显变化。以上结果表明，MeCP2参与了dcx、tuj1、map-2及gfap基因的转录调控过程，提示MeCP2在脑发育过程中发挥着重要作用。
　　结论:
　　1.在大鼠脑发育过程中，npMeCP2及pS80、pS421、pS292MeCP2的表达具有各自特异的变化特点。
　　2.在大鼠脑发育过程中，npMeCP2、pS80MeCP2与pS421、pS292MeCP2具有不同的胞内核浆定位特征。
　　3.在大鼠脑发育过程中，npMeCP2及pS80、pS421、pS292MeCP2主要表达在神经元细胞中，并参与了神经细胞标记基因的转录调控过程。

目录

一．缩略语表(按字母顺序)

摘要

(一)前言

(二)材料与方法

1．实验动物与分组

2．试剂来源

3．仪器设备

4．实验方法

4．1 MeCP2 shRNA质粒小脑延髓池内注射

4．2 冰冻组织切片的制备

4．3 脑片的选取

4．4 免疫组织化学单标记(npMeCP2，pS80、pS421、pS292 MeCP2)

4．5 免疫荧光标记和激光共聚焦扫描技术

4．6 免疫印迹(Immunoblotting)

4．7 染色质免疫共沉淀和荧光定量PCR技术

4．8 RNA提取、逆转录PCR及荧光定量PCR技术

4．9 数据统计学分析

(三)实验结果

1．大鼠发育脑内MeCP2磷酸化修饰位点变化规律的研究

1．1 皮层及小脑内不同位点磷酸化MeCP2蛋白的表达变化研究

1．2 不同位点磷酸化MeCP2在各脑区中表达变化特点的研究

2．磷酸化修饰不同形式MeCP2胞内定位特点的研究

3．磷酸化修饰不同形式MeCP2在神经元和胶质细胞中分布特点的研究

4．不同位点磷酸化修饰对MeCP2与神经细胞标记基因启动子结合能力及其转录调节作用的研究

4．1 大鼠发育脑内不同位点磷酸化MeCP2与神经细胞标记基因启动子的结合能力及其变化特点

4．2 大鼠发育脑内MeCP2靶基因转录及翻译变化规律的研究

5．抑制内源性MeCP2表达对神经细胞标记蛋白表达的影响

(四)讨论

1．大鼠发育脑内不同位点磷酸化MeCP2具有各自特异的时程变化特点

2．不同丝氨酸位点磷酸化修饰改变了MeCP2在细胞内的分布范围

3．丝氨酸磷酸化修饰影响了MeCP2与甲基化DNA的结合能力

4．不同丝氨酸位点磷酸化影响了MeCP2在星形胶质细胞内的分布

5．MeCP2表达缺失影响了新生大鼠脑的正常发育

(五)结论

(六)图版说明

参考文献

五．综述 脑发育与表观遗传调节

致谢

博士研究生期间发表及完成的论文

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