具有光驱质子泵功能的视黄醛膜蛋白及相应高分子复合膜的研究

摘要

本文所研究的对象是一类含有视黄醛的光敏蛋白质及其高分子基复合膜材料，相关研究涉及了高分子科学、生物物理学、分子生物学、信息科学等领域。主要针对紫膜蛋白-细菌视紫红质(BR)的质子泵机理进行深入的探讨，并且拓宽至我国独有紫红膜蛋白-古紫质4(AR4)的机理研究：还制备了这些光敏蛋白质与高分子基质所形成的复合膜，并考察了其光色响应性质。
　　 BR和AR4均为含有视黄醛的膜蛋白，具有7次跨膜螺旋的结构和光驱质子泵的功能；每个光循环导致从胞内侧提取一个质子、向胞外侧释放另外一个质子；在中性条件下，野生型的AR4和BR释放质子和提取质子的时间顺序相反。BR含有248个氨基酸残基，AR4与BR在一级顺序上有59％的相似性。
　　 本论文的主要创新性工作包括：
　　 (一)提出了一种适合去垢剂和不同pH等复杂条件下测量视黄醛蛋白悬浮液光电响应性能的光电化学电解池方法，并解释了去垢剂处理导致古紫质4在中性条件下释放和提取质子的时间顺序发生逆转的原因。课题组前期研究发现，去垢剂Triton X-100可以改变AR4蛋白光循环中的质子提取与释放的顺序，使AR4的质子释放与提取的时间先后顺序变为与BR相同。本研究则揭示，这一反向变化的驱动因素主要是质子释放基团的激发态pKa值发生显著下降所致。我们利用偶联模型对Triton引起的质子泵时间顺序反向的内在原理进行了解释。
　　 (二)发现第77位氨基酸是光驱质子泵的一个重要氨基酸。鉴于AR4与BR在一级顺序上的差别之一是第77位氨基酸，BR为脯氨酸P，AR4为天冬氨酸D；进一步通过其它分析(如：77位靠近质子释放基团等)，我们课题组推测，第77位氨基酸有可能是导致AR4与BR发生差异的重要残基。我们通过合作实现了BR-P77D的基因工程点突变，本博士论文工作进行了后续的突变株培养、突变蛋白质提取以及后续性能表征和研究，尤其是通过系列的滴定实验获得了BR-P77D和相关蛋白质的关键基团的pKa值。本论文工作发现，中性条件下BR-P77D的质子提取和释放的时间顺序介于野生型BR和AR4之间，改变pH则可以实现类似BR或AR4的时间顺序。进一步测量了质子传递的关键基团的pKa等其它重要性质，表明第77位氨基酸对于BR和AR4的质子泵时间次序有举足轻重的影响。
　　 (三)研究了一种具有光色响应性能的光敏功能蛋白质与结构性蛋白质的混合膜材料。我们在BR蛋白质与明胶基质混合的过程中加入交联剂，制备出一种新型的、较稳定的复合膜材料可以承受极端高度碱性条件的处理以及去垢剂的处理。经过该种化学浸泡处理的方法使交联复合膜的光产物M态的寿命显著延长。复合膜干燥后仍然具备光色响应，有望作为一种潜在的信息材料。