NNMR对动脉粥样硬化独立危险因素所致血管内皮细胞凋亡的调控及其分子途径

摘要

本研究室近年研究发现激活非神经性M受体(non-neuronal muscarinicreceptor，NNMR)可改善氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)和同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)所致离体内皮细胞动脉粥样硬化样损伤及高血脂诱发的兔、鹌鹑整体动脉粥样硬化(atherosclerosis，As)病理损伤，降低AS发生率，具确切的防治效果，但其机理尚不明了。深入探讨NNMR对内皮细胞的保护及其抗动脉粥样硬化作用机制可为动脉粥样硬化性相关疾病的防治提供新的治疗策略。 本研究首次系统观察了AS病理损伤状态下，内皮细胞NNMR的表达变化，并进一步观察了激活NNMR对AS独立危险因素所致内皮细胞凋亡的干预作用。研究了激活NNMR对内皮细胞的凋亡形态、凋亡率、凋亡信号分子的影响，旨在闸明激活NNMR保护内皮细胞、抗AS损伤的药理作用及其分子途径。 研究发现在高脂饮食诱发兔动脉粥样硬化模型上，M<,4>表达不变，M<,1>、M<,2>、M<,3>的基因表达水平显著降低，这可能是导致动脉粥样硬化状态下NNMR功能降低的主要原因。 一般形态学、hoechst33342核染色和流式细胞检测法检测表明，槟榔碱、卡巴胆碱和PPVP激活内皮细胞NNMR具有显著的细胞保护作用，表现在：可显著降低ox-LDL和Hcy诱导的内皮细胞凋亡发生率，改善ox-LDL诱导的内皮细胞核形念的病理性改变，减轻Hcy所致细胞形态改变，降低发生皱缩、变圆细胞的细胞比例，减少发生出泡现象的细胞、减少漂浮细胞的数量，降低呈凋亡特征即胞核染包体凝集、染色体边聚化细胞的比例。槟榔碱可浓度依赖性地激动NNMR对抗Hcy和ox-LDL所致大鼠主动脉内皮细胞增殖活性的病理性降低。 对凋亡相关分子基因表达研究发现：以槟榔碱、卡巴胆碱和PPVP激活NNMR均可抑制Hcy所致凋亡线粒体通路中抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-xL的病理性下调，降低促凋亡基因Bax、Fas、Fas-L、Caspase-8的病理性上调；减少Hcy所致凋亡通路下游效应分子p53、Caspase-3和Caspase-6的过表达。对Hcy所致凋亡内质网通路上促凋亡基因Caspase-12的表达无影响。 在蛋白水平上，进一步验证性研究发现槟榔碱、卡巴胆碱和PPVP激活内皮细胞NNMR，均可逆转Hcy所致Bcl-2蛋白表达的病理性降低，抑制Bax和Caspase．3蛋白的病理性上调。 综上所述，NNMR功能降低诱导的内皮细胞凋亡是动脉粥样硬化发生发展的早期始动因素：AS病理状态下NNMR基因表达降低可能是导致NNMR功能低下的主要原因：以激动剂激活NNMR则可显著抑制OX-LDL和Hcy等独立危险因素所致内皮细胞凋亡，其分子途径涉及凋亡的细胞膜途径和线粒体途径中相关基因及凋亡通路中下游效应分子的表达。因此，激活内皮细胞NNMR可显著对抗Hcy和OX-LDL所致细胞凋亡，从而发挥抗动脉粥样硬化作用。

目录

论文说明：缩写与略语

声明

前 言

实验材料

实验方法

1高脂饮食诱发兔动脉粥样硬化模型的制备

2高脂模型兔颈总动脉血管组织和主动脉内皮的采集和处理

3离体主动脉环血管舒张反应的检测

4 HE病理切片的制备

5大鼠主动脉内皮细胞培养及hoechst33342染色观察

6细胞超微结构观察

7细胞增殖抑制率的测定

8流式细胞仪(FCM)检测培养内皮细胞的凋亡

9 RT-PCR法检测基因的表达

10 Western blot(蛋白印迹杂交)

11数据处理

实验结果

第一章高血脂诱发免动脉粥样硬化模型内皮细胞NNMR基因表达的改变

1高脂饮食诱发兔动脉粥样硬化模型

2高血脂状态下NNMR介导内皮依赖性血管舒张反应的改变

3高血脂状态下主动脉内皮细胞M受体亚型基因的表达改变

结语

第二章激活NNMR对ox-LDL和同型半胱氨酸所致内皮细胞凋亡的影响

1激活NNMR对ox-LDL所致内皮细胞凋亡的影响

2激活NNMR对高同型半胱氨酸所致内皮细胞凋亡的影响

结语

第三章激活NNMR对同型半胱氨酸所致内皮细胞凋亡相关基因表达的影响

1激活NNMR对同型半胱氨酸所致RAEC凋亡线粒体途径相关基因表达的影响

2激活NNMR对同型半胱氨酸所致RAEC凋亡细胞膜途径相关基因表达的影响

3激活NNMR对同型半胱氨酸所致RAEC凋亡内质网途径相关基因表达的影响

4激活NNMR对同型半胱氨酸所致RAEC凋亡的效应酶基因异常表达的影响

结语

第四章激活NNMR对同型半胱氨酸所致内皮细胞凋亡相关蛋白表达的影响

1激活NNMR对同型半胱氨酸所致抗凋亡Bcl-2蛋白异常表达的影响

2激活NNMR对同型半胱氨酸所致促凋亡Bax蛋白异常表达的影响

3激活NNMR对同型半胱氨酸所致Bcl-2蛋白与Bax蛋白表达量比值的影响

4激活NNMR对同型半胱氨酸所致凋亡相关Caspase-3蛋白异常表达的影响

结语

讨 论

1 内皮细胞凋亡与动脉粥样硬化发生发展的相关性

2介导内皮细胞凋亡的信号传导系统

3高同型半胱氨酸致内皮细胞凋亡的分子机制

4激活NNMR抗同型半胱氨酸所致内皮细胞凋亡的分子途径

研究结论

参考文献

文献综述 血管内皮细胞非神经性M受体药理学与疾病治疗的研究进展

发表论文

发表论文一

发表论文二

发表论文三

个人简历

致 谢