散发性结直肠癌微卫星不稳定性检测及其与临床病理学特征相关性研究

摘要

结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，在我国居癌症发病率第五位;随着生活水平提高和生活方式及饮食习惯的西化，我国结直肠癌的发病率和死亡率均有上升趋势。2007年上海市恶性肿瘤发病率和死亡率，结直肠癌男性排名第三位，女性排名已至第二位。结直肠癌的发生发展是一个多步骤、多阶段、多基因参与的过程，传统的遗传学改变和表观遗传修饰共同参与了肿瘤的发生发展。具有分子遗传背景的结直肠癌约占25％，75％为散发性结直肠癌(sporadic colorectalcancer，SCRC)，其发生机制颇为复杂。目前认为染色体不稳定(chromosomal instability，CIN)以及癌基因和抑癌基因的变异和DNA错配修复(mismatch repair， MMR)功能缺失导致的广泛微卫星不稳定(microsatellite instability，MSI)是导致大肠癌发生的两大主要基因途径。MSI的检测也具有临床意义，MSI状态与SCRC的预后以及肿瘤对化疗药物的敏感性相关。传统的MSI分子生物学检测方法需要相应的设备和人员，费用昂贵，耗时较长。尽管MMR蛋白缺失状况可以反映肿瘤的MSI状态，但因为检测指标不统一，其敏感性和特异性需要进一步论证，MMR蛋白缺失与SCRC预后的相关性也需要进一步证实。故本课题对上述问题分别报告如下:
　　第一部分散发性结直肠癌错配修复蛋白的表达及其与临床病理特征和预后的相关性研究
　　目的：在散发性结直肠癌(SCRC)中，应用免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)的方法评价4个错配修复(mismatch repair，MMR)基因hMLH1、hPMS2、hMSH2和hMSH6编码的蛋白表达情况，分析错配修复蛋白(mismatch repairprotein，MMRP)表达情况与临床病理学特征的相关性，并探讨MMRP表达与SCRC患者预后的关系。
　　材料与方法：
　　1、收集2007年1月-2009年1月在复旦大学附属肿瘤医院接受诊治的452例SCRC患者的石蜡包埋组织。
　　2、运用全自动免疫组化方法检测癌组织中MLH1、PMS2、MSH2和MSH6的表达情况。四个MMRP中只要一个表达缺失即定义为错配修复蛋白表达缺失(mismatch repair protein defect，MMR-D)，四个MMRP均无表达缺失定义为错配修复蛋白表达正常(mismatch repair protein intact，MMR-I)。
　　3、收集452例SCRC患者的年龄、性别等临床病理资料，通过住院病例查询、电话、门诊随访获得散发性结直肠癌患者随访资料，生存数据为总生存(overall survival，OS)和无病生存(disease-free survival, DFS)时间，分析MMRP表达情况与SCRC的临床病理参数以及预后的关系。
　　结果：
　　1、IHC检测结果:452例SCRC中，43例MMRP表达缺失(MMR-D)，缺失率为9.51％。其中，29例MLH1表达缺失，29例PMS2表达缺失，5例MSH2表达缺失，11例MSH6表达缺失;MLH1、PMS2共同缺失25例，MSH2、MSH6共同缺失4例;1例四个MMRP均缺失。
　　2、MMR-D结直肠癌临床病理特征:右半结肠癌MMRP表达缺失率显著高于左半结肠癌和直肠癌(P＜0.05);MMR-D组肿瘤平均最大径为6.32cm，MMR-I组肿瘤平均最大径为4.27cm，肿瘤最大径＞5cm者MMRP表达缺失率显著高于肿瘤最大径≤5cm者(P＜0.05);低分化者较多发生MMRP缺失表达(P＜0.05)，而未发生远处转移(M0)患者较发生远处转移(M1)患者发生MMRP缺失表达的几率显著提高(P＜0.05)。MMRP表达情况与患者年龄、性别、脉管癌栓、神经侵犯、淋巴结转移情况以及临床病理分期无显著相关性。
　　3、生存分析
　　(1)452例SCRC中具有完整随访资料者442例，失访10例。442例SCRC的无病生存率和总生存率分别为70.8％(313/442)、78.5％(347/442)。局部复发率、远处转移率、病死率分别为14.5％(64/442)、25.3％(112/442)、21.5％(95/442)。
　　(2) MMR-D组43例中有1例失访;6例术后局部复发，复发率14.3％;发生远处转移5例，其中3例肝转移，1例骨转移，1例全身广泛转移，转移率11.9％;死亡3例，病死率7.1％。MMR-I组409例，有9例失访。58例局部复发，复发率14.5％，与MMR-D组差异不具有统计学意义;转移107例，转移率26.8％，死亡92例，病死率23％，显著高于MMR-D组(P＜0.05)
　　(3)Kaplan-Meier单因素生存分析显示MMR-D组总生存(OS)率显著优于MMR-I组(P＜0.05)，无病生存率也较MMR-I组高，但不具有统计学意义(P＞0.05)。COX比例风险模型分析显示MMRP表达是SCRC总生存率独立的预后因素(P＜0.05)。
　　第二部分散发性结直肠癌微卫星状态与错配修复蛋白表达的对照性研究
　　目的：应用多重荧光PCR(polymerase chain reaction)-毛细管电泳方法检测SCRC的微卫星不稳定(MSI)状态，将检测结果与MMRP的IHC检测结果进行比较分析，探讨IHC检测MMRP表达的方法筛选MSI表型SCRC患者的敏感性和特异性，以评价其临床实际应用的可行性。
　　材料与方法：
　　1、根据第一部分中IHC检测结果，选取43例MMR-D及101例MMR-I病例，分别收集两组病例的肿瘤和相应的正常结直肠组织，均为常规石蜡包埋组织。
　　2、分别提取肿瘤和相应的正常结直肠组织的DNA。
　　3、采用多重荧光PCR-毛细管电泳法检测两组病例的5个标准微卫星位点(BAT25，BAT26，D2S123，D5S346，D17S250)的MSI状态，以Genemapper软件分析PCR产物并判断肿瘤微卫星状态。5个位点中至少2个位点有重复序列长度变化定义为高频MSI(High level of microsatellite instability，MSI-H)，只有一个位点有长度变化定义为低频MSI(Low level of microsatelliteinstability，MSI-L)，无任何位点的变化定义为微卫星稳定(microsatellitestability，MSS)。
　　结果：
　　1、PCR检测结果:受检的144例SCRC中，41例为MSI-H，3例为MSI-L，100例为MSS。MMR-D组43例中，MSI-H37例，MSI-L1例，MSS5例;MMR-I组101例中， MSI-H4例， MSI-L2例，MSS95例。
　　2、IHC检测与PCR检测结果对照分析:两种方法检测结果符合率为93.1％(134/144)，一致性检验结果kappa值=0.832(P＜0.05)。IHC检测的敏感性为90.2％(37/41)，特异性为97％(97/100)。
　　3、生存分析:Kaplan-Meier单因素生存分析显示MSI-H患者总生存(OS)率及无病生存(DFS)率均显著优于MSS/MSI-L患者(P＜0.05)。
　　结论：
　　(1)本研究中有9.51％的SCRC发生MMRP的表达缺失，MMRP的表达缺失较常发生在右半结肠癌，低分化癌、无远处转移的结直肠癌以及肿块较大的病例。
　　(2)MMRP的表达缺失和/或MSI-H患者预后较好，无病生存及总生存率均优于MMRP阳性和/或MSS/MSI-L患者，MMRP表达状况是SCRC总生存率独立的预后因素。
　　(3)运用IHC联合检测MLH1、MSH2、PMS2、MSH6蛋白表达的方法筛选SCRC中错配修复功能缺陷的MSI表型患者，与运用PCR-毛细管电泳法检测MSI具有较高的一致性，可以在临床实际应用中常规开展。与PCR-毛细管电泳法相比，IHC方法操作简单，快速，成本低，更具优势。

目录

摘要

前言

参考文献

第一部分 散发性结直肠癌错配修复蛋白的表达及其与临床病理特征和预后的相关性研究

引言

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

第二部分 散发性结直肠癌微卫星状态与错配修复蛋白表达的对照性研究

引言

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

全文总结

文献综述 散发性结直肠癌中微卫星不稳定性检测的研究进展

致谢

英文缩略词

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