先天性心脏病新候选基因原钙粘蛋白20对斑马鱼发育的影响与机制

摘要

先天性心脏病（congenital heart disease，CHD）简称先心病，是指胚胎发育过程中心脏结构发生异常的一类疾病。近年来出生缺陷调查资料显示，先心病已跃居我国出生缺陷畸形首位，发病率占活产新生儿的6‰-10‰。圆锥动脉干畸形(congenital conotruncal defects，CTD)是一类复杂性先天性心脏病，约占青紫型先心病的70％。CTD是指在遗传和环境因素的共同作用下，胚胎发育早期心脏流出道和大动脉发育异常，临床上表现为法洛四联症(tetralogy ofFallot，TOF)、肺动脉闭锁(pulmonary atresia，PA)、大动脉转位(transpositionof great arteries，TGA)、右室双出口(double outlet right ventricle，DORV)、永存动脉干(persistent truncus arteriosus，PTA)等多种复杂的心血管畸形，是导致儿童复杂畸形和高死亡率的主要原因。
　　遗传因素在CTD的发病过程中发挥重要作用，但其遗传方式、外显率等均不清楚，易感基因尚未确定。由于圆锥动脉干发育异常引起的CHD手术远期效常常较差，如果能找到CTD的致病基因，阐明它们导致心脏发育异常的机制，则不仅有助于CHD的产前诊断，而且有望对CTD的防治提供靶点。
　　本课题组前期采用罗氏NimbleGen全基因组外显子捕获芯片获得10例CTD患儿的全基因组外显子区序列，通过Solex和SOLiD二代高通量测序发现了一批非同义突变的基因，其中包括原钙粘附蛋白20(Protocadherin20，PCDH20)基因。在本论文的第一部分，我们选取了200例CTD患者和200例正常对照，通过测序发现有1例CTD患者的PCDH20在CDS序列第1549位点存在点突变，正常对照中没有此种突变。
　　PCDH20属于钙粘蛋白家族中的非簇原钙粘蛋白分子，其编码基因定位于13q21染色体，编码的蛋白含有6个胞外钙粘蛋白域(cadherin ectodomains，EC)、跨膜结构域和胞质结构域，具体功能不明。本研究利用斑马鱼作为模式生物，通过吗啡林修饰的反义寡核苷酸技术干扰目标mRNA翻译的方法研究下调pcdh20对斑马鱼胚胎发育尤其是对心脏发育的影响。
　　PCDH20的cDNA共编码951个氨基酸残基，蛋白质分子量约105KD。生物信息学分析显示PCDH20在脊椎动物的进化过程中，基因结构和蛋白质功能结构域上相对保守（同源性56％）。斑马鱼早期胚胎及成鱼表达谱研究显示，pcdh20在整个斑马鱼发育阶段呈持续性表达，表达部位主要位于心脏、中枢、肝脏和眼睛等，说明pcdh20是一个重要的看家基因，可能对多个组织器官的发育产生影响。
　　pcdh20含2个外显子，只有一个转录本，第1外显子片段较第2外显子小。我们设计了两个吗啡啉修饰的反义寡核苷酸pcdh20+intron1-MO和pcdh20-ATG-MO，分别干扰剪接功能和翻译起始位点，由此建立了pcdh20基因表达下调的斑马鱼模型。实验证实, pcdh20+intron1-MO成功地干扰了pcdh20的剪接功能，pcdh20-ATG-MO成功地抑制了pcdh20-EGFP融合蛋白的表达。
　　在胚胎整体发育水平上，我们运用胚胎整体原位杂交方法分析pcdh20基因表达下调后循环和血液系统标志性基因的表达情况。结果显示，vmhc与amhc表达无明显差异，但心房缩小，呈条索状改变。固兰染色发现，pcdh20下调后斑马鱼红细胞减少。此外，pcdh20下调后，斑马鱼脑部发育也有改变，神经元标志基因elavl1、神经胶质细胞标志基因gfap、中后脑边界发育的基因pax2a、神经嵴细胞相关基因sox10的表达均出现下调。
　　在pcdh20影响斑马鱼心脏和大脑发育的机制方面，我们发现斑马鱼的凋亡增加。因此我们推测，pcdh20可能是通过促进细胞凋亡导致斑马鱼心脏、红细胞及大脑发育异常。

目录

中英文缩略词表

摘要

前言

第一部分 hPCDH20基因在先天性心脏病圆锥动脉干畸形中的变异

1．实验材料和方法

2．实验结果

3．讨论

第二部分 下调pcdh20基因对斑马鱼胚胎发育的影响

第一节 pcdh20基因在脊椎动物中的保守性及斑马鱼的表达特点

1．实验材料与方法

2．实验结果

3．小结

第二节 pcdh20基因表达下调斑马鱼模型的建立

1．实验材料和方法

2．实验结果

3．小结

第三节 pcdh20基因表达下调对斑马鱼心脏发育和红细胞的影响

1．实验材料和方法

2．实验结果

3．小结

第四节 pcdh20基因表达下调对斑马鱼中枢神经系统发育的影响

1．实验材料和方法

2．实验结果

3．小结

讨论

全文总结和展望

论文创新性

参考文献

综述 原钙粘蛋白的研究进展

待发表论文及会议情况

致谢

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