雌激素在痛相关厌恶情绪反应中的作用及机制

摘要

疼痛是一种复杂的感觉体验，与其他躯体感觉不同，疼痛最鲜明的特征就是带有强烈的情绪色彩，当人们感受到疼痛时，总伴随有强烈的负面情绪（如厌恶、恐惧、焦虑、抑郁等）和对痛刺激的回避行为。1994年国际疼痛学会(IASP)明确定义:疼痛是一种与组织损伤或潜在损伤相关的不愉快的主观感觉和情绪体验。对疼痛感觉成分的研究自古希腊便已开始，随着研究手段的不断革新，迄今为止已在整体、细胞、分子和基因等各个层次上都得到巨大的进展。而由于对情绪这一指标的研究相对比较困难，对痛情绪成分的研究在近年才渐渐通过设计良好的动物模型以及相应的检测技术来进行检测和量化。更为重要的是，越来越多的临床观察表明，久治不愈的慢性痛患者所遭受的恶性情绪，如焦虑、恐惧、孤独、厌世等给病人造成了比疼痛本身更为严重的身心创伤。因此，研究并揭示痛情绪反应的机制，使人们更为全面地理解疼痛，可以为受疼痛困扰的患者提供有效的综合治疗手段并使其不良情绪反应得到及时的缓解。
　　大脑的各个脑区在情绪、记忆和痛觉的产生与传导中有着不同的分工，并发挥着不同作用。前扣带皮层(Anterior Cingulate Cortex，ACC)属于边缘系统的重要结构，是参与痛觉调制的重要中枢，主要负责处理疼痛相关的情绪和情感组分。大量实验结果证实，ACC特别是吻侧部(rACC)神经元可对伤害性刺激或预示伤害性刺激的线索发生反应，伤害性刺激和疼痛引起的不愉快感受也可以激活ACC脑区。临床研究表明，切除包括ACC在内的周围皮层组织可以减轻患者的痛情绪反应，但不影响对疼痛刺激的强度和部位的判断。因此，ACC参与处理疼痛的不愉快感受，促进与疼痛相关的情感、认知和反应的抉择，并参与与情感性痛觉组分的整合和其他感觉信息的处理过程。
　　17β-雌二醇(estradiol，E2)是女性体内最强的天然雌激素，它不仅来源于卵巢，也可以在脑内局部通过芳香化酶催化胆固醇或雄激素而产生。E2具有多种生物学功能，通常作为机体进行生殖、分化、细胞增殖、凋亡、炎症、代谢、内循环稳定等的关键调节因子。越来越多的证据表明，雌激素对调节大脑发育、突触可塑性和学习记忆等脑内高级功能也发挥着重要作用。那么雌激素对于疼痛所带来的不良情绪是否也有相应的调节作用？作为一种性激素，雌激素参与痛情绪调节的作用是否有性别差异？雌激素是通过快速调节的非基因作用还是经典的基因型作用调控痛厌恶情绪？其作用机制又是什么？本研究围绕这一系列问题，采用动物行为学、离体rACC脑片切片全细胞膜片钳记录、免疫组织化学、细胞培养和活细胞检测等实验方法，观察了rACC内雌激素在痛厌恶情绪反应中的作用，研究了E2对于rACC神经元兴奋性突触传递和LTP的影响，并对其可能的细胞和分子机制进行了探讨。主要结果如下:
　　1.脑源性雌激素是痛相关厌恶情绪形成的关键因子
　　大鼠单侧后爪皮下注射5％福尔马林溶液50μl，在雌雄两组大鼠均可引起条件性位置回避。这种由稀释的福尔马林引起的条件性位置回避(F-CPA)已被证明可以反映痛相关厌恶情绪。在双侧rACC内微量注射雌激素受体(ERs)拮抗剂ICI182，780(ICI)或芳香化酶（雌激素合成所需的关键酶）抑制剂androstatrienedione(ATD)后，雄性和雌性大鼠均无法诱发F-CPA，提示rACC中的内源性雌激素是痛情绪形成所必需的。双侧卵巢切除(OVX)的雌性大鼠仍能形成F-CPA，但rACC内微量注射ATD后，F-CPA在OVX大鼠被完全阻断。进一步证明脑源性雌激素在痛厌恶情绪形成中的重要作用。
　　2.外源给予雌激素能直接诱导厌恶情绪的形成
　　为了检测雌激素本身是否足以引起CPA，我们在不给予福尔马林伤害性刺激的条件下，直接向双侧rACC中微量注射E2。意外地发现E2能直接引起大鼠的条件位置回避行为（即形成E-CPA），且同样没有雌雄差异。ERs拮抗剂ICI能完全阻断E-CPA的形成，提示该作用是ERs依赖的。以大分子结合的E2(E2-BSA，膜雌激素受体激动剂)代替E2进行微量注射，发现E-BSA能模拟E2的作用，提示E2诱导的CPA主要是由膜雌激素受体(mERs)介导的。为了进一步分析E-CPA形成的分子机制，我们在rACC中微量注射了NMDA受体选择性的拮抗剂APV，发现APV能完全阻断E2所诱导的CPA。ACC内微量注射兴奋性氨基酸同磺丙氨酸(HCA)也可引起CPA，但rACC双侧微量注射ICI并不能显著影响HCA引起的CPA，提示而ERs可能位于NMDA受体的上游。
　　3.雌激素激活ERK-CREB和NMDA受体NR2B发挥其快速作用，和磷酸化ERK和CREB发挥其快速作用
　　取大鼠rACC脑薄片，以含E2(100 nM)的外液孵育10分钟后，固定脑片行免疫组织化学染色。结果显示，磷酸化ERK(pERK)和CREB(pCREB)在rACC的表达水平显著上调;预先以NMDA受体拮抗剂APV孵育脑片，E2引起的pERK和pCREB上调被明显阻断。我们在整体动物rACC内微量注射E2后30 min，断头取脑，Western blot检测rACC内NMDA受体NR1、NR2B和pNR2B蛋白表达水平。结果显示，E2快速上调pNR2B在rACC内的表达，NR1和NR2B无明显改变。该结果提示E2在rACC内可能通过快速激活的胞内信号行使其非基因组功能。
　　4.雌激素受体在rACC神经元的分布
　　免疫组织化学染色显示，ERα、ERβ和GPR30在rACC中有大量表达。ERα和ERβ免疫阳性细胞主要分布在第Ⅲ层，GPR30免疫阳性细胞广泛分布于第Ⅱ-Ⅴ层。在rACC内，ERα和ERβ主要表达在椎体神经元，在胞核、胞浆、胞膜和突起上均由分布，与神经元标志物NeuN和细胞骨架蛋白标记物MAP2和βⅢ-tubulin广泛共标。GPR30主要表达在神经元的胞浆和/或胞膜中。并且这三种雌激素受体与谷氨酸能神经元标记物Glutamate(Glu)和NMDAR的结构亚基NR1均有大量共标。
　　5.雌激素对兴奋性突触传递的调节
　　我们采用脑片全细胞膜片钳方法，记录出生后15-21天的大鼠rACCⅡ/Ⅲ层锥体细胞的电活动。雌激素(100 nM)灌流rACC脑片5-10分钟后，并不影响神经元动作电位的发放频率，膜输入阻抗(Rin)和神经元静息膜电位(Vm)水平也未见显著变化，提示雌激素并不影响神经元的基本电生理特性和神经元放电。灌流给予浓度递增的E2(10nM，100 nM and1μM)可在数分钟内快速增强电刺激诱导的兴奋性突触后电流(eEPSC)的幅度，并能显著增加E2增强eEPSCs的概率。进一步分析eEPSCs的成分显示，E2显著增强NMDA-EPSC/AMPA-EPSC的比值。突触前和突触后机制都可能参与E2对兴奋性突触传递的增强。
　　6.雌激素对rACC神经元兴奋性突触可塑性的影响
　　将细胞钳制在-40mV，灌流100nME26分钟，能够快速增强NMDA-EPSCs并能长时程维持这一增强效应，持续达40分钟以上。钳制细胞在-70mV，E2灌流6分钟，能快速减小AMPA-EPSC。与NMDA-EPSC长时程增强不同，AMPA-EPSC减小的现象在20分钟之后恢复，30分钟时恢复到基础值。膜雌激素受体(mER)的激动剂E2-BSA同样也能诱导出NMDA-LTP，且NMDA-EPSC增大的幅度与E2诱导的类似。在记录电极的电极内液中加入了G蛋白抑制剂GDP-β-S能够完全阻断E2所引起的NMDA-EPSCs长时程增强的现象，PKA选择性拮抗剂H89或NR2B的拮抗剂Ifenprodil也能阻断E2诱导NMDA-EPSC长时程增强，说明雌激素快速诱导的NMDA-LTP是通过GPCR、PKA和NR2B介导的。Theta波刺激(theta-burststimulation，TBS)也可在ACC稳定诱导出LTP，预先灌流ERs拮抗剂ICI可部分阻断LTP，提示内源性E2对参与LTP的诱导。
　　7.雌激素的快速作用可以促进ACC神经元树突棘的生长
　　我们在原代培养的ACC锥体神经元上连续记录120 min的树突棘形态和生长情况。E2处理后5分钟，ACC神经元总树突棘（或树突纤维）的密度和长度以及平均树突棘（或树突纤维）的密度和长度都有了明显增加，持续103分钟以上。该结果提示，雌激素可以通过促进ACC神经元树突棘的生长增强兴奋性突触的功能。
　　综上所述，rACC局部合成的脑源性E2作为一种神经调质，可能通过快速增强兴奋性突触传递和可塑性参与痛厌恶情绪的形成。

目录

缩略词表

摘要

一、前言

二、材料和方法

1 材料

1．1 实验动物

1．2 实验药品及试剂

1．3 实验仪器及工具软件

2 实验方法

2．1 行为学实验

2．2 ACC脑片的制备及电生理记录

2．3 ACC神经元原代培养

2．4 免疫荧光化学实验

2．5 Western blot

2．6 微透析实验

三、结果

1 内源性雌激素参与痛相关厌恶情绪的形成

1．1 雌雄大鼠可建立相似的F-CPA

1．2 阻断rACC内雌激素受体或抑制雌激素合成能阻断F-CPA形成，但不影响福尔马林伤害性刺激引起的急性痛反应

1．3 阻断PFC内雌激素受体不能阻断F-CPA的形成

1．4 卵巢雌激素剥夺大鼠仍能形成F-CPA

1．5 福尔马林伤害性刺激能引起rACC局部雌激素快速合成和释放

2 外源性雌激素通过调控NMDA受体参与厌恶情绪的形成

2．1 外源性雌激素在ACC内能引起CPA的形成

2．2 雌激素引起的CPA主要通过rACC内的膜雌激素受体介导

2．3 雌激素通过激活NMDA受体通路参与痛厌恶相关情绪的形成

3 雌激素通过磷酸化NMDA受体NR2B和磷酸化ERK-CREB发挥其快速作用

3．1 雌激素快速磷酸化NMDA受体NR2B

3．2 雌激素通过激活NMDA受体激活ERK-CREB信号通路

4 雌激素受体在rACC内的分布

4．1 不同亚型的雌激素受体在rACC神经元的亚细胞分布

4．2 不同雌激素受体在雌雄大鼠脑内的合成和表达的细胞类型

5 雌激素对兴奋性突触传递的调节

5．1 雌激素对rACC神经元基本电生理学特性的影响

5．2 雌激素快速增强rACC神经元兴奋性突触后电流

5．3 雌激素快速增大NMDA-EPSC／AMPA-EPSC比值

5．4 雌激素的快速作用对于突触后NMDAR和AMPAR有不同作用

5．5 雌激素增强突触前谷氨酸释放

6 雌激素对rACC神经元兴奋性突触可塑性的影响

6．1 雌激素快速诱导NMDAR介导的长时程增强

6．2 雌激素通过膜受体诱导NMDA-LTP

6．3 GPCR、PKA和NR2B介导NMDA-LTP的形成

6．4 内源性雌激素参与theta波刺激诱导的LTP形成

7 雌激素的快速作用促进ACC神经元树突棘的生长

四、讨论

1 伤害性刺激激活的脑源性雌激素在痛情绪形成过程中发挥关键作用

2 雌激素快速增强rACC脑区的兴奋性突触传递

3 膜雌激素受体介导的G蛋白依赖的快速信号通路参与突触可塑性的形成和痛情绪的建立

4 树突棘形态、突触可塑性和痛相关厌恶情绪间的相互关系

五、总结

参考文献

综述 前扣带皮层参与痛情绪的神经机制

博士期间已发表文章

博士期间待发表的文章

获得资助

获奖情况

参加学术交流

致谢

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