乙肝疫苗免疫不应答群体的蛋白组和microRNA组表达差异性研究

摘要

全球有超过20亿人感染过乙肝病毒。乙肝疫苗接种是预防乙肝的最有效方法，但仍有5％-10％的人群，对于乙肝疫苗免疫后不能有效的产生免疫应答反应。目前对于乙肝免疫不应答机理的研究主要集中在免疫系统缺陷和MHC多态性等方面，但尚无血浆蛋白组学相关研究报道。实际上，血浆/血清是最复杂的人类蛋白组，包含了不同组织的亚蛋白组，能够动态的反映个体的整体生理状态。在临床上，血浆/血清的检测作为一种非侵入性的检测方法得到普遍应用。并发展出了多种重要疾病的检测指标。血浆蛋白组及miRNAs组相关的疾病检测标记研究已经成为研究热点。
　　在本课题中，为了研究乙肝不应答人群的血浆蛋白组差异，找到不应答相关的分子标记，我们共采集高应答、无应答人群血浆各54例，正常对照人群血浆21例作为样本。使用MARS多重亲和柱去除血浆中14种高丰度蛋白后，进行荧光差异双向电泳实验，差异蛋白点经质谱分析，鉴定到维生素D结合蛋白(VDBP)、α1微球蛋白、Afamin、抗凝血酶-Ⅲ、激肽原(KNG1)、α1-抗糜蛋白酶、纤链蛋白(VN)，共7个差异蛋白。经过Western blot、ELISA验证以及统计学分析(P＜0.05)，α1微球蛋白、激肽原(KNG1)在无应答人群血浆中含量高于应答人群，α1-抗糜蛋白酶则在高应答人群血浆含量中更高。
　　在血清miRNAs组学研究部分中，我们共收集到新鲜血清样本:高应答39例、无应答44例、正常对照22例。通过芯片技术进行大规模miRNAs扫描，在高应答、无应答组之间已初步确定了12个差异，二者和正常对照组相比共计37个差异。
　　另外，为了进一步研究HBV病毒和宿主之间的相互作用，探究HBV-X基因对宿主细胞蛋白组的影响，我们使用实验室前期构建的可调控表达HBV-X基因的HepG2细胞株，进行双向电泳实验，在使用Dox诱导和未诱导的两组间共找到10个具有显著差异的蛋白。
　　我们的研究中，首次对乙肝免疫高应答、无应答人群的血浆/血清进行了蛋白组和miRNAs组的差异研究，发现了3种差异蛋白和12个潜在的差异miRNAs。3种差异蛋白均在肝脏中表达，并具有重要的免疫调节功能。为找到预测乙肝疫苗免疫效果的分子标记以及进一步阐述乙肝免疫不应答的机理奠定了基础。

目录

声明

摘要

第一部分 前言

第一章 乙肝疫苗免疫不应答相关研究进展

第二章 血浆／血清蛋白组学研究基本情况介绍

第三章 HBV相关的临床蛋白组学研究进展

第四章 microRNAs概述

第二部分 论文正文

第一章 HepG2-X细胞蛋白组学研究

第一节 材料与方法

第二节 HepG2-X细胞双向电泳实验条件优化

第三节 HepG2-X细胞蛋白组学研究

第二章 乙肝疫苗免疫不同应答水平人群血浆蛋白组学研究

第一节 材料及方法

第二节 各种试剂盒相关的试剂及使用方法

第三节 乙肝免疫不同应答水平人群血浆荧光差异凝胶电泳实验

第四节 实验结果与讨论

第三章 乙肝疫苗免疫不同应答水平人群血浆差异蛋白的鉴定实验

第一节 材料及方法

第二节 各种试剂盒相关的试剂及使用方法

第三节 使用Western blot和ELISA方法验证7种差异蛋白实验设计

第四节 差异蛋白鉴定实验结果

第五节 差异蛋白鉴定实验结果讨论

第四章 microRNAs芯片实验

第一节 实验材料和方法

第二节 乙肝疫苗免疫不同应答水平人群的血清miRNAs组学实验设计

第三节 实验结果与讨论

参考文献

致谢

附录