PA-MSHA联合吉非替尼对不同基因表达状态的肺腺癌作用的实验研究

摘要

第一部分 PA-MSHA联合吉非替尼对不同基因表达状态的肺腺癌作用的体外研究
　　目的:肺癌的发病率逐年上升，在目前世界范围内已成为人类恶性肿瘤死亡的首要原因。在发达国家中，肺癌的5年生存率仅约10％-15％，而在我国则更低。肺癌中大约80％是非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)，肺癌发病较为隐匿，通常患者前来就诊时已属晚期。晚期NSCLC如果不治疗，中位生存期仅约4-5个月，1年生存率更是低于10％。晚期NSCLC目前的一线标准治疗仍是以铂类为基础的两药方案化疗，通过化疗患者的中位生存期可以延长到1年左右，但是化疗带来的不良反应仍然影响着患者的生活质量。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)在NSCLC的发生发展过程中起了重要作用，以EGFR为靶点的小分子靶向药物的出现为肺癌患者的治疗带来了新的希望。其中，吉非替尼(Gefitinib)和厄洛替尼（Erlotinib）为代表的酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor, TKI)是目前被多国批准并广泛应用于晚期NSCLC的小分子靶向药物。但是，并非所有的NSCLC患者都对EGFR-TKI有效，而且即使所有采用EGFR-TKI治疗有效的患者，最终仍不可避免地发生耐药，所以，我们需要探索更多疗效好、毒性低、又适合我国国情的药物。研究者一直致力于肺癌的靶向治疗研究的研究，但是直至目前为止，尚未发现一种理想的、能够很好地满足临床需要的提高EGFR-TKI疗效的药物。
　　PA-MSHA(Pseudomonas aeruginosa, Mannose-sensitive hemagglutination)是我国自主研发一种治疗用生物制剂。铜绿假单胞菌甘露糖敏感血凝菌毛株的菌毛是其运动器官和黏附感染器官，其结构基因和运动功能基因经证明定位在染色体DNA上，化学性质以蛋白质为主。目前作为免疫调节剂的研究有报道，然而对于其抗肿瘤作用及机制的报道很少。有研究发现其特有的MSHA菌毛能够与乳腺癌细胞表面EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)受体上的甘露糖分子特异性结合，阻断EGFR受体及其胞内信号分子的活化，进而抑制乳腺癌细胞的生长并诱导其凋亡。然而，PA-MSHA在肺腺癌中的作用还不清楚;PA-MSHA是否能够成为新的、有价值的治疗NSCLC的药物尚有待进一步研究证实。
　　材料与方法:在本部分的研究中，我们通过选择不同基因表达分型的肺腺癌细胞株，通过使用PA-MSHA单药，吉非替尼单药，联合用药和设立对照，然后通过MTT法来观察肿瘤细胞抑制情况，通过流式细胞术来检测细胞凋亡情况和细胞周期变化情况，通过免疫印迹法来探讨药物抗肿瘤作用的信号转导通路变化从而揭示其作用机制。
　　结果:我们发现，在三种不同基因表型的肺腺癌细胞株中，PA-MSHA单药都能对肿瘤细胞产生抑制，这种抑制作用表现为浓度依赖性和时间依赖性，浓度范围相对是中等偏低的剂量级（0.156，0.313，0.625，1.25*10^9/ml），随着药物浓度增高，细胞抑制率与对照比较有显著差异(p＜0.05);其次，PA-MSHA能导致细胞周期重新分布，使三种细胞株的细胞sub-G1期的细胞比例升高，而S期细胞比例降低，与对照比较有显著差异(p＜0.05); PA-MSHA能诱导凋亡，A549，PC-9，NCI-H1975三种细胞在中等偏低的浓度(0.625*10^9/ml)PA-MSHA作用下，凋亡比例分别达到了8.4％，11.85％，13.69％，与对照比较有显著差异(p＜0.05);PA-MSHA能下调EGFR信号转导通路下游蛋白表达。而在联合了吉非替尼后，这些作用能够增强，即使在EGFR-TKI耐药的细胞株中也能表现。
　　结论:因而，PA-MSHA可能是一个通过作用于EGFR通路的抑制剂来起到抗肿瘤作用，而联合EGFR-TKI能够使这种抗肿瘤作用得到明显增强。
　　第二部分 PA-MSHA联合吉非替尼对不同基因表达状态的肺腺癌作用的体内研究
　　目的:目前，晚期非小细胞肺癌的治疗疗效水平仍较低，而EGFR-TKI的耐药也成为其治疗的主要瓶颈，EGFR-TKI的耐药机制目前有不少研究，但是仍未彻底明确，至于如何来增加TKI药物的有效性，不论临床前和临床都有不少尝试，但总体效果不佳或存在较大的局限性。PA-MSHA是一种菌毛株，广泛应用于临床的免疫支持治疗，毒副作用较小，前期有研究发现其具有抑制EGFR信号转导通路的作用。我们的研究已表明，在细胞水平，PA-MSHA单药能对三种不同基因表型的肺腺癌细胞株产生抑制，导致细胞周期重新分布于sub-G1期，并能诱导凋亡，且下调EGFR信号转导通路下游蛋白表达。而在联合了吉非替尼后，这些作用能够发生协同，提示PA-MSHA在肺腺癌中有可能成为一个不同于EGFR-TKI和单抗的另一类EGFR通路抑制剂，并且有望提高EGFR-TKI的有效性，然后其作用的体内表现及机制尚未明确，以及通过临床前研究确定未来作为该药抗肿瘤临床研究的应用剂量仍需进一步探讨。
　　材料与方法:本部分我们构建了不同基因表型的肺腺癌细胞株的动物模型，通过设置了对照、PA-MSHA单药、吉非替尼单药及PA-MSHA联合吉非替尼各组，来观察裸鼠肿瘤的生长情况、体重变化情况、以及免疫印迹法来检测凋亡通路及EGFR通路蛋白变化情况，再以RNA干扰技术反向验证EGFR通路的抑制情况。从而，通过完整的体内实验来明确PA-MSHA对于肺腺癌的作用机制和靶点，并且验证其对于EGFR-TKI耐药逆转的可能性及机制。
　　结果:本研究我们建立了EGFR-TKI原发耐药、继发耐药、敏感的细胞株的裸鼠模型。实验发现，在不同肺癌细胞株的裸鼠模型中，PA-MSHA能够明显抑制瘤体的生长，在45天最终观察日，A549单用PA-MSHA肿瘤平均体积为428.6mm3，而在联合应用吉非替尼后这种作用得到增强，肿瘤平均体积为279.5mm3，与对照和单用吉非替尼及单用PA-MSHA比较都有显著差异，p＜0.05; PC-9单用PA-MSHA肿瘤平均体积为453.5mm3，单用PA-MSHA肿瘤平均体积为352.6mm3，而在联合应用吉非替尼后这种作用得到增强，肿瘤平均体积为187.8mm3，与对照和单用吉非替尼及单用PA-MSHA比较都有显著差异，p＜0.05; H1975单用PA-MSHA肿瘤平均体积为520.6mm3，而在联合应用吉非替尼后这种作用得到增强，肿瘤平均体积为253.7mm3，与对照和单用吉非替尼及单用PA-MSHA比较都有显著差异，p＜0.05。随后我们发现了EGFR信号转导通路两条主要下游通路的磷酸化蛋白表达受到了抑制，比如p-Akt，p-ERK等。另外，我们利用RNA干扰技术，通过EGFR-siRNA来阻断PA-MSHA与EGFR的结合，结果发现了，PA-MSHA对EGFR通路的抑制作用得到了阻断，从而从反向验证的角度阐述了PA-MSHA对EGFR通路的作用机制。
　　结论:我们的研究显示，PA-MSHA在肺癌中能够抑制肿瘤细胞增殖，诱导凋亡，并且导致细胞周期重新分布，抑制EGFR信号转导通路，而且联合吉非替尼能够增强抗肿瘤作用，通过研究，我们首次，揭示了PA-MSHA作为免疫调节剂参与了非小细胞肺癌的靶向治疗。近年来，非小细胞肺癌的个体化治疗，EGFR-TKI耐药的研究都成为了热点和难点，本研究的发现，将为将来PA-MSHA在非小细胞肺癌尤其是提高EGFR-TKI治疗有效性的临床研究提出新的理论依据和治疗途径。

目录

主要英文缩略词表

摘要

图表清单

第一部分 PA-MSHA联合吉非替尼对不同基因表达状态的肺腺癌作用的体外研究

前言

第一章 PA-MSHA联合吉非替尼对不同基因表达状态的肺腺癌抗肿瘤作用的观察

1．材料和方法

2．结果

第二章 PA-MSHA联合吉非替尼对不同基因表达状态的肺腺癌抗肿瘤作用相关机制研究

1．材料和方法

2．结果

讨论

小结

参考文献

第二部分 PA-MSHA联合吉非替尼对不同基因表达状态的肺腺癌作用的体内研究

前言

第一章 不同基因分型肺腺癌裸鼠移植瘤模型构建与肿瘤生长情况观察

1．材料和方法

2．结果

第二章 PA-MSHA联合吉非替尼对不同基因表达状态的肺腺癌作用的体内研究

1．材料和方法

2．结果

讨论

小结

参考文献

后续研究 吉非替尼联合或不联合PA-MSHA注射液治疗一线失败的晚期非小细胞肺癌的临床研究

全文总结与展望

综述 PA-MSHA抗肿瘤作用的研究进展

后记 研究生期间发表的论文和所受到的奖励

致谢

声明