调节性T细胞移植对实验动物脑缺血损伤的保护作用

摘要

目的:脑缺血损伤可诱发强大的免疫炎症反应。免疫系统与缺血的脑组织之间的相互作用参与了脑中风的病理形成，因而成为了中风治疗的一个新靶点。近期的研究提示CD4+CD25+调节性T细胞(CD4+CD25+regulatory T cells，Tregs)作为一种自身的免疫调节细胞，其功能障碍可加重脑缺血后的脑损伤，因此可能是机体对抗脑缺血损伤后脑内炎症反应的一种内源性的自身保护机制。然而，目前尚未有研究对外源性给予调节性T细胞静脉移植输注是否可对脑缺血损伤起到保护作用进行过评估。故本研究拟1）明确调节性T细胞的静脉移植输注在啮齿类动物脑缺血模型中的神经保护作用;2）探讨潜在的细胞保护作用机制。
　　方法:免疫磁珠双重选择细胞提取法提取健康成年C57BL/6J小鼠及SD大鼠CD4+CD25+调节性T细胞。线栓法制备小鼠及大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)模型，缺血60分钟（小鼠）或120分钟（大鼠）后再灌注。将实验动物随机分为假手术对照组(Sham)、脑梗死组(MCAO)，脑梗死组又分为静脉输注PBS组，静脉输注脾细胞(splenocytes，Sp)组和静脉输注调节性T细胞(Tregs)治疗组。分别于术后24h和72h对各组动物进行神经行为学评价，并在MCAO后3天，7天及28天对脑切片进行TTC染色或MAP2免疫组化染色，计算机图像分析系统测量脑梗死体积。各组动物于静脉输注调节性T细胞24h以及72h后经心脏取血并灌注后取脑制备脑组织冰冻切片，用免疫组织化学方法染色检测外周免疫细胞在脑组织中的浸润。用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血浆基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和炎性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ、TGF-β表达水平的变化。为进一步探讨调节性T细胞所产生的神经保护作用，我们联合采用了Gr-1抗体特异性消除中性粒细胞，MMP-9基因敲除以及骨髓嵌合子技术以及体外Treg与中性粒细胞的共培养技术。通过流式细胞仪分析外周免疫细胞评估Treg治疗对于全身免疫功能的影响。
　　结果:在小鼠局灶性脑缺血模型中，MCAO后2、6或24小时后静脉输注提纯的调节性T细胞可减少脑缺血后的脑梗死面积约50％，对神经功能的改善可持续至MCAO后28天。MCAO后2小时给予Treg静脉输注治疗具有最显著的治疗效果，且在大鼠脑缺血模型中也具有保护作用。值得一提的是脑缺血后Treg的有效治疗窗可长达24小时。在脑缺血后1天，脑内炎症反应、外周炎症细胞在损伤区脑组织内的浸润以及血脑屏障的破坏显著减轻。
　　应用CD45.1的同类系小鼠以及细胞示踪技术，我们惊喜地发现Treg的神经保护作用并不需要其浸润至脑组织内或抑制小胶质细胞的激活，提示其可能在外周循环中发挥保护作用。应用Gr-1抗体中和消除体内中性粒细胞，基因敲除MMP-9或将MMP-9基因敲除的骨髓转移至野生型经照射的小鼠体内都可消除Treg的神经保护作用，显示Treg是通过抑制外周中性粒细胞来源的基质金属蛋白酶-9的产生，从而防止了血脑屏障的破坏。Treg与中性粒细胞共培养的体外实验进一步证实了Treg是通过细胞间相互接触的方式抑制中性粒细胞的MMP-9产生的。除了中枢神经保护作用以外，Treg治疗还显示出对中风后低淋巴血症具有缓解作用，提示此治疗有望改善中风后的免疫状态。
　　结论:本研究提示CD4+CD25+调节性T细胞静脉输注移植是一种以中风后免疫功能紊乱为靶点的创新而有效的细胞治疗方法。调节性T细胞输注移植治疗通过抑制外周中性粒细胞MMP-9的产生保护了血脑屏障从而达到了早期的神经保护作用。

目录

摘要

前言

材料和方法

一、实验动物

二、脑缺血动物模型

三、激光散斑成像技术测定脑血流

四、免疫磁珠两步法提取CD4+CD25+调节性T细胞

五、分选细胞的流式分析

六、神经功能行为学评价

七、TTC染色测定脑梗死体积

八、明胶酶谱

九、Real-time PCR

十、示踪剂的静脉给药、定量以及检测

十一、透射电子显微镜

十二、免疫组化与免疫荧光染色

十三、图像处理与分析

十四、细胞因子的酶联免疫吸附测定(ELISA)

十五、骨髓移植构建骨髓嵌合子

十六、中性粒细胞来源的MMP-9的体内实验分析

十七、中性粒细胞的原代培养与处理

十八、统计学分析

实验结果

一、Treg静脉输注移植显著减轻了脑缺血再灌注后的脑损伤

二、Treg改善了脑缺血后的功能恢复并具有长时程的神经保护作用

三、Treg减轻了脑内炎症反应并在其自身浸润脑组织前减少了外周免疫细胞的脑浸润

四、Treg治疗不加重中风后的免疫抑制

五、Treg治疗保护了脑缺血后血脑屏障的完整性

六、Treg治疗通过抑制MMP-9的升高对脑缺血起到了保护作用

七、中性粒细胞来源的MMP-9是Treg神经保护作用的主要靶点

讨论

参考文献

致谢

综述 中枢神经与外周免疫系统在脑缺血后的分子对话

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