乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA(HBV cccDNA)的甲基化及其调控HBV复制和基因表达的作用研究

摘要

尽管乙肝疫苗已普遍接种，乙型肝炎病毒（HBV）感染仍是一个严重的公共卫生问题。HBV属于嗜肝DNA病毒，进入宿主肝细胞核后形成共价闭合环状DNA(cccDNA)，以cccDNA为模板转录生成前基因组RNA(pre-genomic RNA，pg RNA)是HBV复制周期中的关键环节。本研究分为三个部分：
　　第一部分分析了176例基因型A-J的HBV核苷酸序列中CpG岛(CpG island，CGI)的分布及各型之间的差异。通过MethPrimer软件分析发现HBV基因组有三个CpG岛，存在被DNA甲基化修饰的基础。岛Ⅰ跨HBV S基因起始位点，岛Ⅱ紧邻核心启动子，和增强子Ⅰ、Ⅱ，与X基因启动子重叠，岛Ⅲ包含HBV P基因的起始位点以及S基因启动子sp1。并且作为DNA甲基化作用靶点的CpG双核苷酸在不同基因型HBV序列中的分布存在明显差异，部分基因型HBV岛Ⅰ缺失。基因型C、F、G、H和J基因型以2岛分布为主，A、B、D、E和Ⅰ基因型以3岛分布为主。基因型B、C、D和H基因型中存在新的CGI。基因型C与基因型B的岛Ⅰ区域的GC含量存在显著差异。
　　第二部分分析了30例中国慢性乙型肝炎(CHB)患者肝组织中HBV cccDNA3个CpG岛的甲基化分布情况。所有入选的患者均未接受过任何抗病毒治疗。通过亚硫酸氢盐转化方法处理肝组织中提取到的HBV cccDNA，PCR扩增病毒基因组中的3个CGI，基因测序分析其甲基化程度。本实验的分析结果显示CHB患者肝组织中的HBV cccDNA存在一定程度的甲基化。其中，岛Ⅰ中CpG双核苷酸的胞嘧啶极少发生甲基化，只在5例(18.5％)的患者中检测到少数位点发生甲基化。岛Ⅱ的甲基化与血清病毒载量存在良好的线性关系，低病毒复制组(Log10 copies/mL＜5)的岛Ⅱ甲基化程度显著高于高复制组(Log10copies/mL≥5)，提示岛Ⅱ的甲基化抑制病毒复制，可能与核心启动子活性受抑有关。年龄也是岛Ⅱ发生甲基化的相关因素，年龄≥40岁患者的岛Ⅱ甲基化程度高于年龄＜40岁组。此外，基因型C患者的岛Ⅱ甲基化程度高于基因型B组;HBeAg(-)患者岛Ⅱ甲基化程度高于HBeAg(+)组;肝脏纤维化分期为S3-4患者的岛Ⅱ甲基化程度高于纤维化分期S0-2组。我们的数据还发现，发生在岛Ⅲ的甲基化与血清低HBsAg滴度有关，推测与sp1启动子活性受抑有关。
　　第三部分对体外研究HBV中单个CpG岛功能的方法进行了探索。目前仅有的HBV DNA甲基化体外研究方法是:采用DNA甲基转移酶体外对3.2kb HBV线性单体进行笼统的修饰后，转染肝癌细胞系HepG2后，用real-time方法检测病毒mRNA的转录水平，该方法明确了体外DNA甲基化抑制HBV病毒RNA的转录。但是，这种方法无法分析单个岛的功能，即不能明确DNA甲基化介导转录抑制的作用靶点。在本实验中，我们通过PCR方法分别扩增CpG岛(PCR产物不含甲基，而质粒有甲基化修饰)，在体外对其进行甲基化修饰后，再与其互补DNA片段连接成完整的3.2kb HBV环状单体，体外转染HepG2细胞后，通过Northern blot和Southem blot分别检测乙肝病毒的转录和复制水平，发现岛Ⅱ甲基化的HBV单体的RNA转录水平以及病毒复制显著低于对照组，即岛Ⅱ甲基化参与HBV cccDNA转录活性的调控，与第二部分的实验结果也是一致的。此外，既往的观点认为，乙肝病毒的核心蛋白参与组成胞核内的病毒微染色体，通过改变染色体构象调节cccDNA的转录活性。本实验将核心蛋白正常表达或表达缺失的HBV线性单体转染HepG2细胞，检测发现其HBV RNA转录水平无显著差异，即在核心蛋白缺失的情况下，体外瞬时转染HBV线性单体，HepG2细胞中的cccDNA转录水平没有明显差别。

目录

缩略词

摘要

第一部分 乙型肝炎病毒不同基因型中CpG岛的分布

1．1 前言

1．2 材料与方法

1．3 结果

1．4 讨论

小结

参考文献

第二部分 慢性乙型肝炎患者肝组织中HBV cccDNA的甲基化分析

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．3 结果

2．4 讨论

小结

参考文献

第三部分 HBV cccDNA基化调控乙肝病毒复制与基因表达的体外研究

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．3 结果

3．4 讨论

小结

参考文献

总结和展望

综述 肝细胞内乙型肝炎病毒(HBV)的甲基化及其意义

博士研究生期间发表的论文

在读期间参加的国际会议

致谢

声明