丙型肝炎病毒NS4A与钙离子信号调节亲环素配体相互作用的研究

摘要

目的：探讨丙型肝炎病毒非结构蛋白4A(HCV NS4A)与钙离子信号调节亲环素配体(CAML)的相互作用、作用位点及相互作用后对细胞基因表达的影响。 方法：应用酵母双杂交技术筛选人白细胞文库中与HCVNS4A相互作用的蛋白。对克隆重复率较高的CAML基因进行克隆，并构建其酵母表达载体，在酵母细胞中与HCV NS4A进行回交验证之后，构建HCV NS4A(pCMV/Myc-NS4A)及CAML(pcDNA3.1/His-A-CAML)的真核表达载体，共转染293细胞，进行免疫共沉淀验证实验。构建CAML不同剪接体及缺失突变体的酵母表达载体，转染入酵母Y187，分别在酵母细胞中与转染了HCV NS4A酵母表达载体(pGBKT7-NS4A)的AH109进行配合，寻找HCV NS4A与CAML相互作用的具体位点。将HCV NS4A真核表达载体转染入稳定转染CAML的293细胞，利用基因芯片技术检测二者相互作用后对细胞基因表达的影响。 结果：筛选出在铺有x-α-gal的四缺培养基上能够生长并变成蓝色的真阳性菌落45个，其中包括29个CAML。对CAML基因成功克隆，在酵母细胞中回交验证了HCV NS4A与CAML的相互作用。构建了HCV NS4A及CAML的真核细胞表达载体，并利用免疫共沉淀技术在293细胞中验证了两者的相互作用。包含CAML蛋白氨基末端1～57位氨基酸的CAML不同缺失突变体及剪接体的酵母表达载体转染入酵母Y187后，均可以与转染pGBKT7-NS4A的AH109成功配合。 基因芯片筛选结果提示转染HCV NS4A后的稳定转染了CAML基因的293细胞中共有48种基因的表达水平上调，36种基因的表达水平下调，其中与Rho蛋白信号转导相关基因6种。 结论：在293细胞中HCV NS4A与CAML存在相互作用，其相互结合的位点位于CAML蛋白亲水的氨基末端1～57位氨基酸。二者相互作用可以使细胞内的一系列基因表达发生改变，其中包括与细胞凋亡相关的Rho蛋白信号转导相关基因。HCV NS4A可能通过与CAML相互作用对Rho GTPases信号通路活性产生影响，赋予细胞对凋亡的抵抗，并可能由此而参与丙型肝炎病毒感染慢性化的机制。

目录

论文说明：英文缩写词表

声明

摘要

引 言

第1部分 酵母双杂交技术筛选人白细胞cDNA文库中HCV NS4A结合蛋白

1.1前 言

1.2实验材料

1.3实验方法

1.3.1诱饵质粒在酵母菌株AH109中的表达

1.3.2诱饵与白细胞文库的酵母配合

1.3.3配合效率分析

1.3.4阳性克隆的蓝白筛选

1.3.5提取酵母质粒

1.3.6酵母质粒PCR

1.3.7酵母质粒转化大肠杆菌DH5α及酶切鉴定

1.3.8根据测序结果，在GenBank中进行比对分析

1.4实验结果

1.4.1 pGBKT7-NS4A在酵母菌株AH109中表达

1.4.2配合效率分析

1.4.3在四缺/X-α-gal培养基上生长的真阳性菌落

1.4.4筛选克隆PCR扩增鉴定结果

1.4.5筛选克隆BglⅡ酶切鉴定结果

1.4.6 cDNA测序与同源性分析初步结果

1.5讨 论

第2部分CAML基因及其不同剪接体的克隆及生物信息学分析

2.1前 言

2.2实验材料

2.3实验方法

2.3.1 CAML基因克隆

2.3.2 CAML不同剪接体的克隆

2.3.3克隆产物生物信息学分析

2.4实验结果

2.4.1 CAML基因及其不同剪接体PCR扩增结果

2.4.2 CAML及其不同剪接体克隆的酶切鉴定结果

2.4.3测序及生物信息学分析结果

2.5 讨 论

第3部分HCV NS4A与CAML相互作用的证实

3.1前 言

3.2实验材料

3.3实验方法

3.3.1 CAML基因酵母表达载体构建

3.3.2 pGADT7-CAML转化酵母Y187菌株

3.3.3回交验证实验

3.3.4 HCV NS4A及CAML基因真核表达载体构建

3.3.5免疫共沉淀实验

3.4实验结果

3.4.1构建的CAML酵母表达载体

3.4.2回交验证实验结果

3.4.3构建的HCV NS4A基因真核表达载体

3.4.4构建的CAML基因真核表达载体

3.4.5免疫共沉淀及Western Blotting检测结果

3.5讨 论

第4部分HCVNS4A与CAML相互作用位点的确定

4.1前 言

4.2实验材料

4.3实验方法

4.3.1 CAML基因不同剪接体酵母表达载体构建

4.3.2 CAML基因不同缺失突变体酵母表达载体构建

4.3.3转化CAML不同剪接体及缺失突变体酵母表达载体至酵母Y187菌株

4.3.4转化HCV NS4A酵母表达载体至酵母AH109菌株

4.3.5配合试验

4.4实验结果

4.4.1 CAML基因不同剪接体酵母表达载体酶切鉴定结果

4.4.2 CAML基因不同缺失突变体酵母表达载体酶切鉴定结果

4.4.3 HCV NS4A酵母表达载体酶切鉴定结果

4.4.4 CAML基因不同剪接体与HCV NS4A在酵母细胞中相互配合结果

4.4.5 CAML基因不同缺失突变体与HCV NS4A在酵母细胞中相互配合结果

4.5讨 论

第5部分应用基因芯片技术探讨HCV NS4A与CAML相互作用对细胞基因表达的影响

5.1 前 言

5.2实验材料

5.3实验方法

5.3.1 CAML稳定转染细胞株的筛选及建立

5.3.2 pCMV/Myc-NS4A转染至pcDNA3.1/HisA-CAML稳定转染细胞株

5.3.3细胞mRNA提取

5.3.4探针标记及杂交

5.3.5检测与分析

5.4实验结果

5.4.1总RNA及mRNA的定性、定量分析

5.4.2 HCV NS3蛋白上调及下调表达基因

5.4.3与Rho蛋白信号转导相关基因

5.5讨论

参考文献

结论

文献综述

第1部分酵母双杂交系统的原理及研究进展

1.1酵母双杂交系统基本原理

1.2酵母双杂交系统的应用

1.3酵母双杂交系统的优点

1.4酵母双杂交系统的局限性

1.5酵母双杂交系统的进展

1.6参考文献

第2部分钙离子信号调节亲环素配体研究进展

2.1 CAML的生物学特性

2.2 CAML在钙离子信号转导中的作用

2.3目前已鉴定的CAML相互作用蛋白

2.4 CAML对病毒感染的意义

2.5参考文献

博士在读期间发表论文

发表论文一

发表论文二

致谢