IL-17A在系统性硬皮病患者血管病变发病中作用机制的研究

摘要

系统性硬皮病(SSc)是一种系统性自身免疫性结缔组织病，病因和发病机制尚不十分清楚，主要表现为皮肤硬化和内脏器官纤维化，有较高的致残率和病死率，SSc至今尚无控制SSc病情发展和抗纤维化的满意的治疗方法。SSc血管病不仅是该病的早期表现，而且伴随疾病的整个过程，对该病发生、发展和预后都有非常重要的作用。但迄今为止，SSc患者的血管病的发生机制尚不清楚，对该机制进行研究，犹如对疾病的源头和早期过程进行研究，有利于寻找方法对该病进行早期干预，这对于目前尚无满意的抗纤维化药物治疗该病的状况尤为重要。
　　近年来，分泌IL-17的CD4+T细胞（Th17细胞）在人类疾病发生发展中的作用受到越来越多的关注。IL-17A是Th17细胞分泌的主要致炎因子。越来越多的研究发现SSc是一个Th17细胞相关的疾病。部分研究推测，SSc患者外周血中IL-17的浓度与病情活动度有相关性。我们研究发现，在SSc患者发病的早期阶段，血管周围浸润着较多的IL-17+细胞。于是我们推测，Th17细胞可能是参与硬皮病血管病发病的重要因素。迄今为止，Th17细胞与SSc发病的相关性研究还是初步的，还没有涉及Th17细胞与SSc血管病发病之间关系的研究。于是本研究以SSc患者和健康对照者的血液标本、皮肤组织和培养细胞为材料，采用ELISA、流式细胞分析、免疫组织化学、RT-PCR和Western-Blot等方法，探索了Th17细胞在SSc患者血管内皮损伤、凋亡和胶原合成中的作用和可能的机制。
　　我们的工作显示，SSc患者的PBMCs的IL-17A mRNA的表达较健康对照者明显增高。同时，SSc患者血清中IL-17A的表达较健康对照者明显增高。SSc患者皮肤组织中表皮层、真皮层和皮下组织层中血管周围都可观察到IL-17+细胞的浸润，健康对照组皮肤各层均未见IL-17+细胞浸润。源自于SSc患者血清的IL-17A诱导血管内皮细胞高水平表达粘附分子和趋化因子从而引起血管内皮细胞的炎症，并可以招募更多的T淋巴细胞粘附到血管内皮细胞，发现ERK信号通路可能是参与IL-17A引起的血管内皮细胞的炎症的信号通路之一。原位检测发现SSc患者皮肤组织中血管内皮细胞的凋亡增加，同时血管周围有较多的IL-17+细胞浸润。IL-17A体外可诱导血管内皮细胞凋亡增加，这种作用可以被IL-17A的中和抗体抑制。IL-17A体外诱导皮肤成纤维细胞增殖和分泌较高的Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维，IL-17A体外诱导人皮肤成纤维细胞向纤维母细胞转化并表达α-SMA，ERK信号通路可能参与这种转化。综上所述，我们的研究提示IL-17A可能参与SSc患者血管内皮细胞的炎症和凋亡，并诱导皮肤成纤维细胞向纤维母细胞转化从而导致胶原合成增加，其在SSc发病中具有重要作用。
　　第一部分 SSc患者外周血和皮肤组织中IL-17A的表达
　　目的:探讨IL-17A在SSc患者外周血和皮肤组织的变化，探索IL-17A是否与SSc的发病有关。
　　方法:用ELISA检测22例SSc患者和18例健康对照者血清中IL-17A的分泌情况;用荧光定量PCR(real-time PCR)检测SSc患者和健康对照者外周血PBMCs中IL-17A mRNA的表达情况;用免疫组化的方法检测SSc患者和正常对者皮肤组织中IL-17+细胞的表达和分布。
　　结果:22例SSc患者血清中IL-17A（50.58±12.23 pg/ml）较18例健康对照组血清中IL-17A（29.48±5.65pg/ml）表达明显增加，差别具有统计学意义(P＜0.05);SSc患者外周血PBMCs中IL-17A mRNA表达较正常对照组显著增加，差别具有统计学意义(P＜0.05);SSc患者皮损组织中表皮层、真皮层和皮下组织脂肪小叶间隔中的血管周围有较多的IL-17+细胞的浸润，正常对照者皮肤组织中各层血管周围均未见IL-17+细胞的浸润。
　　结论:SSc患者外周血和皮肤血管周围IL-17A的表达增高可能与SSc患者血管病的发生有关。
　　第二部分 SSc患者的血管内皮细胞炎症与外周血中增高IL-17A关系的研究
　　目的:探讨IL-17A引起SSc患者血管内皮细胞炎症的发生机制。
　　方法:体外培养人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)和人微血管内皮细胞(HMEC-1)，SSc患者血清和IL-17A体外预刺激HUVECs和HMEC-1，real-timePCR和Western Blot检测HUVECs和HMEC-1粘附分子和趋化因子的表达;并采用Western Blot法观察IL-17A可以激活哪些HUVECs的细胞信号通路，这些信号通路与HUVECs表达增加粘附分子和趋化因子的关系;HUVECs与T细胞共培养，研究IL-17A预刺激是否可以诱导T细胞对HUVECs的粘附。
　　结果:IL-17A和SSc患者血清可诱导HUVECs和HMEC-1粘附分子VCAM-1、ICAM-1和趋化因子CCL-20和CXCR-4表达增加，同时可诱导T细胞对HUVECS的粘附增加;IL-17A可激活HUVECs的MAPK-P38和MAPK-ERK信号通路，其中MAPK-ERK信号通路参与了HUVECs粘附分子和趋化因子表达的增加，同时MAPK-ERK信号通路诱导了T细胞对HUVECs的粘附。
　　结论:在SSc患者血液中IL-17A可能通过ERK信号通路诱导血管内皮细胞的炎症。
　　第三部分 SSc患者血管内皮细胞凋亡与IL-17A的关系
　　目的:明确IL-17A是否参与SSc患者血管内皮细胞的凋亡。
　　方法: TUNEL原位榆测和免疫组化法检测SSc患者和正常对照者皮肤组织中血管内皮细胞是否有凋亡增加，以及SSc患者血管周围IL-17+细胞浸润是否增加;IL-17A体外刺激人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)，流式细胞仪检测刺激前后HUVECs的凋亡是否有增加。IL-17A体外刺激人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)，WB法检测刺激前后HUVECs的凋亡基因caspase-3、抗凋亡基因bcl-2和拮抗促凋亡基因bax的变化。
　　结果:TUNEL原位染色和免疫组化染色显示SSc患者皮肤组织中血管内皮细胞凋亡明显增加，血管周围有较多IL-17+细胞浸润。流式细胞仪检测到IL-17A体外刺激的血管内皮细胞可诱导血管内皮细胞的凋亡增加WB法检测发现凋亡基因caspase-3表达增加，抗凋亡基因bcl-2和拮抗促凋亡基金bax的表达呈相反趋势。IL-17A诱导血管内皮细胞凋亡的这种作用可以被IL-17A中和抗体拮抗。
　　结论:IL-17A可能诱导血管内皮细胞的凋亡增加。
　　第四部分 SSc患者的皮肤成纤维细胞胶原合成增加与IL-17A的关系
　　目的:明确IL-17A是否诱导人皮肤成纤维细胞分泌胶原的增加和向纤维母细胞的转化。
　　方法:从青少年包皮中分离的正常皮肤成纤维细胞，IL-17A体外刺激皮肤成纤维细胞，CCK8法检测IL-17A刺激前后是否可以引起皮肤成纤维细胞的增殖;ELISA法和WB法检测IL-17A刺激前后成纤维细胞分泌的Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原变化:WB法和细胞免疫荧光方法检测α-SMA的表达变化;WB法检测IL-17A可以激活哪些成纤维细胞信号通路，以及信号通路抑制剂对α-SMA表达的影响;
　　结果:CCK8法检测发现不同浓度梯度5ng/ml、10ng/ml和20ng/ml的IL-17A刺激皮肤成纤维细胞1-4天，可以促进人皮肤成纤维细胞的增殖。ELISA法和Western Blot法检测发现，浓度为10ng/ml的IL-17A刺激人皮肤成纤维细胞24小时，IL-17A可以促进其合成Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原增加。IL-17A刺激人皮肤成纤维细胞3天，可以诱导成纤维细胞向纤维母细胞转化，并特异性表达α-SMA。Western Blot法检测发现IL-17A可以激活皮肤成纤维细胞的ERK信号通路，ERK信号通路的抑制剂可以抑制α-SMA的表达。
　　结论:IL-17A可以促进人皮肤成纤维细胞胶原合成增加，同时诱导其成纤维细胞向纤维母细胞转化。

目录

声明

英文缩略词表

摘要

引言

第一部分 SSc患者外周血和皮肤组织中IL-17A的表达

前言

材料与方法

结果

讨论

第二部分 SSc患者的血管内皮细胞炎症与外周血中增高IL-17A关系的研究

前言

材料和方法

结果

讨论

第三部分 SSc患者血管内皮细胞凋亡与IL-17A的关系

前言

材料和方法

结果

讨论

第四部分 SSc患者的皮肤成纤维细胞胶原合成增加与IL-17A的关系

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

全文总结

文献综述 系统性硬皮病发病机制中始动因素的研究现状

一、博士期间已发表的论文

二、博士期间待发表的论文

三、博士期间参与的课题情况

四、博士期间参加的会议

致谢