细胞自噬在血液恶性肿瘤治疗中的作用和机制研究

摘要

第一部分重组人精氨酸酶(rhArg)对非何杰金淋巴瘤的细胞毒性及细胞自噬在rhArg杀伤非何杰金淋巴瘤细胞中的作用研究
　　近年来，靶向细胞代谢尤其是精氨酸代谢治疗肿瘤受到了大量关注。精氨酸酶是一种精氨酸降解酶，对多种恶性实体瘤均有杀伤效果。本课首次研究了rhArg对非何杰金淋巴瘤(NHL)细胞的细胞毒性。细胞自噬真核细胞内遗传保守的蛋白质降解途径，在维持细胞内环境稳态及细胞增殖、分化和死亡等过程中起重要作用，与肿瘤治疗息息相关。研究表明生长因子、氨基酸缺乏等外界刺激会诱导细胞自噬。但精氨酸酶能否诱导NHL细胞自噬尚未见报道，本课题首次研究了rhArg诱导NHL细胞自噬以及细胞自噬在rhArg杀伤NHL细胞中的作用和机制。
　　选择NHL研究中最常用的细胞株Raji和Daudi作为体外模型。细胞经rhArg处理后，用MTT法检测细胞活力，用流式细胞术检测细胞凋亡和线粒体膜电位;用电子显微镜和激光共聚焦显微镜观察细胞自噬体、western blot检测细胞自噬相关蛋白或细胞凋亡相关蛋白的表达。用siRNA沉默细胞凋亡调控基因caspase3、细胞自噬调控基因ATG5和Beclinl。rhArg处理细胞后，用自噬抑制剂3-methyladenine(3-MA)和chloroquine(CQ)抑制细胞自噬。
　　本研究结果表明:0.016到4 IU/mL的rhArg均能通过耗竭精氨酸显著降低Raji和Daudi细胞的细胞活力。1IU/mL的rhArg处理Raji和Daudi细胞24、48或72 h能诱导细胞凋亡和caspase3的剪切，用20μM的z-VAD-fmk或siRNA抑制caspase3会显著减弱rhArg诱导的细胞凋亡。rhArg能引起自噬体的出现，诱导LC3Ⅱ的表达。rhArg诱导的细胞自噬伴随着mTOR/S6K信号通路的抑制。用细胞自噬抑制剂3-MA(2 mM)、CQ(20μM)或siRNA方法沉默自噬调节基因ATG5和Beclin1抑制细胞自噬均能显著增强rhArg诱导的Raji和Daudi细胞生长抑制和细胞凋亡。
　　综上所述，rhArg对NHL细胞具有显著的细胞毒性。rhArg能显著诱导NHL细胞自噬。抑制细胞自噬能显著增强rhArg对NHL细胞的细胞毒性。
　　第二部分同时抑制Hedgehog(Hh)信号通路和细胞自噬克服Bcr-Abl+CML耐药性的研究
　　药物耐药性是慢性髓性白血病(CML)治疗中的最大挑战之一。Hh信号通路和细胞自噬均与肿瘤发生、治疗和药物耐有密切关系。但细胞自噬与Hh信号通路在CML里的调节关系以及与CML耐药的联系尚不清楚。本课题首次研究了在CML中Hh对细胞自噬的调节作用，以及通过同时抑制Hh信号通路和细胞自噬来克服CML耐药性的可能性。
　　本研究选用了伊马替尼敏感的K562和BaF3-Bcr-Abl细胞及伊马替尼耐药性的BaF3-Bcr-AblT3151和BaF3-Bcr-AblY253F细胞。用Hh抑制剂或细胞自噬抑制剂单独或联合使用处理上述细胞。用电子显微镜、激光共聚焦显微镜和westernblot检测细胞自噬、用CCK-8法检测细胞活力、用Annexin V/PI标记法检测细胞凋亡。
　　研究结果表明:在Bcr-Abl+CML细胞中，用Hh抑制剂vismodegib抑制Hh信号通路能诱导细胞自噬体的产生、LC3Ⅱ蛋白的增加。Vismodegib单独使用时对CML细胞的生长抑制作用不显著，而与细胞自噬抑制剂CQ联合使用则能显著抑制CML细胞生长、诱导细胞凋亡。以伊马替尼为阴性对照，发现同时抑制Hh信号通路和细胞自噬能显著降低耐药性的Bcr-Abl+ CML细胞的活力、同时诱导细胞凋亡。此外，Vismodegib和CQ联合使用对正常人外周血单个核细胞(PBMCs)的细胞活力无明显影响。Hh抑制剂和细胞自噬抑制剂联合使用引起的Bcr-Abl+ CML细胞死亡与PARP、caspase3和caspase9剪切、线粒体膜电位降低以及mTOR和Bcr-Abl信号通路的抑制有关。
　　综上所述，在CML中抑制Hh信号通路会诱导细胞自噬。同时抑制Hh信号通路和细胞自噬能显著杀伤伊马替尼敏感和耐药的Bcr-Abl+ CML细胞。本研究表明，同时抑制Hh信号通路和细胞自噬可能是一种有效的克服CML耐药性的新策略。

目录

缩略词

摘要

第一章 重组人精氨酸酶(rhArg)对非何杰金氏淋巴瘤的细胞毒性及细胞自噬在rhArg杀伤非何杰金氏淋巴瘤细胞中的作用研究

第一节 引言

第二节 实验部分

1．1 实验材料

1．2 实验方法

1．3 实验结果及分析

1．4 讨论

1．5 小结

第二章 同时抑制Hedgehog(Hh)信号通路和细胞自噬克服Ber-Abl+CML耐药性的研究

第一节 引言

第二节 实验部分

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 实验结果及分析

2．4 讨论

2．5 小结

全文总结

创新点

参考文献

文献综述 细胞自啦在白血病治疗中的作用及机制研究进展

附录

硕士期间的研究成果及所获荣誉

致谢

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