姜黄素纳米粒(NanoCurcTM)联合索拉非尼对肝细胞癌生物学特性的协同作用及机制研究

摘要

原发性肝癌发病率位列全世界第五、我国第三的恶性肿瘤。根据世界卫生组织预计，在2030年前，肝癌都将保持持续增长，其病死率更是高居第二位[1]。近几年，肿瘤治疗虽然取得了长足进步，诸如手术、介入、肝移植等方法的采用，但肝癌总体5年生存率仍仅15％[2，3]。超过60％的肝癌患者在初次就诊时已经进入中晚期并伴有转移、复发，从而失去手术治疗的机会。因此，抗肿瘤药物的研究显得极为重要，成为进一步提高肝癌生存率的关键。
　　肿瘤的发生发展、侵袭转移是一个多步骤的复杂动态过程。化学治疗因其自身优点受到越来越多的重视，对抗肿瘤转移效果好且副作用小药物的需求更是不断增加。越来越多的研究将目光投向天然产物。天然产物已经成为抗癌药物的重要来源，约70％抗肿瘤药物提取自天然产物[4]。此外，联合用药方案具有提高抗肿瘤疗效、延缓耐药性的产生，而毒性增加不多的优点，为抗肿瘤提供了新的对策。
　　本研究主要探讨姜黄素纳米粒(NanoCurcTM，NC)联合索拉非尼对肝细胞癌生物学特性的影响。采用体外细胞增殖检测试剂盒（CCK-8），体外划痕实验和Transwell侵袭实验法检测NC联合索拉非尼对人肝癌细胞生长增殖、迁移、侵袭能力的影响。随后应用流式细胞术分析对细胞周期、凋亡的作用。建立MHCCLM3-RFP裸鼠皮下成瘤和原位成瘤模型并观察NC联合索拉非尼对肿瘤大小、肺转移率的影响。最后探讨NC和/索拉非尼抗肿瘤效应的可能机制，为防治肝癌提供新的可能药物。
　　第一部分 NC联合索拉非尼对人肝癌细胞生物学特性的影响
　　本研究旨在通过肝癌细胞系Huh7和MHCCLM3体外实验，探索NC和／或索拉非尼对肿瘤细胞生长、迁移、侵袭以及细胞周期、细胞凋亡等生物学行为的影响。
　　利用NC和/或索拉非尼药物对Huh7和MHCCLM3细胞系进行处理。随后采用体外细胞增殖检测试剂盒（CCK-8）检测NC和/或索拉非尼处理前后细胞增殖能力的变化;划痕实验检测迁移能力的变化;Transwell小室实验检测细胞侵袭能力的改变。进一步通过流式细胞术分析对细胞凋亡及细胞周期的影响。
　　结果显示，NC和/或索拉非尼处理后，肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力都显著降低，且NC和/或索拉非尼对肝癌细胞增殖迁移抑制能力相似（P＜0.01）。然而，NC和索拉非尼联合应用对肝癌细胞侵袭能力的抑制作用显著优于NC或索拉非尼单独处理后(P＜0.05)。流式细胞术实验结果与细胞增殖实验相一致，NC和/或索拉非尼可显著升高肝癌细胞早、晚期凋亡及坏死细胞比例，而NC和索拉非尼联合应用对坏死细胞增高程度显著优于NC或索拉非尼单独处理后。与NC或索拉非尼单独处理相比，联合处理后G2/M期细胞比例显著增高(P＜0.01)。
　　以上结果表明，NC联合索拉非尼能够协同抑制肝癌细胞增殖，降低迁移和侵袭能力，增加细胞早、晚期凋亡及坏死比例。对细胞的抑制增殖作用与G2/M期阻滞相关。
　　第二部分 NC联合索拉非尼对肝癌裸鼠模型生物学特性的影响
　　本研究旨在通过建立肝癌原位和皮下小鼠模型，探索NC和/或索拉非尼在体内实验中对肿瘤细胞生长以及转移等生物学行为的影响。
　　通过建立人高转移MHCCLM3-RFP皮下和原位移植瘤模型，研究NC和/或索拉非尼给药与否对肿瘤大小的影响。获取新鲜肺组织，通过荧光成像显微镜观察肺组织中的转移灶（转移灶为标记RFP的肿瘤组织），并通过H&E染色确定肺转移情况。
　　结果显示，4周后NC组、索拉非尼组、联合组和对照组(给予PBS)的原位肿瘤大小有显著性差异，分别为(0.75±0.14) cm3 vs(0.50±0.11)cm3 vs(0.45±0.09) cm3 vs(1.26±0.13) cm3;肺转移率分别为50.0％，66.7％，16.7％，100％。
　　体内实验表明，NC和索拉非尼联合应用能够抑制肝癌生长，减少肺转移的数目。
　　第三部分 NC联合索拉非尼对肝细胞癌生物学特性影响机制的研究
　　为了探讨NC联合索拉非尼抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的内在机制，本研究从信号通路和肝癌干细胞两方面入手。一方面，NC与索拉非尼联合应用可协同抑制ERK磷酸化，减少NF-kB/p65 DNA结合，从而下调MMP-9的表达，进而发挥抗肿瘤转移的作用。另一方面，NC与索拉非尼联合也能协同抑制肝癌干细胞——CD133+肝癌细胞的数量。
　　首先对Huh7及MHCCLM3细胞系进行研究，借助RT-PCR、ELISA、Westernblot从蛋白质、RNA层面对ERK1/2/NF-kB/MMP9信号通路进行了检测，并使用MMP-9抑制剂TIMP-1加以验证。其次借助RT-PCR、ELISA、Western blot及免疫组化染色在裸鼠肝癌组织中再次进行上述检测。最后采用细胞流式技术对体外CD133+的肝癌细胞进行定量分析研究，采用免疫组化染色对裸鼠肝癌组织中CD133指标进行检测。
　　上述实验结果显示，在体内及体外中，NC联合索拉非尼均可使ERK1/2的磷酸化程度明显降低，NF-kB/p65 DNA结合减少，最终导致MMP-9的表达下调，提示两药联合可能通过该信号通路协同对肿瘤细胞的增殖、侵袭进行调控。我们运用MMP-9抑制剂TIMP-1后，发现联合用药组中TIMP-1表达量最多。此外，无论是细胞系还是裸鼠肝癌组织中，两药联合均可使CD133+肝癌细胞显著降低。
　　综合以上结果，我们认为NC与索拉非尼可通过协同抑制肿瘤细胞的ERK1/2/NF-kB/MMP-9通路影响肿瘤侵袭、转移能力，同时还能杀伤肝癌干细胞——CD133+肝癌细胞，防止肿瘤复发。

目录

缩写

摘要

引言

第一部分 NC联合索拉非尼对人肝癌细胞生物学特性的影响

前言

一、材料与仪器

二、方法

三、结果

四、讨论

第二部分 NC联合索拉非尼对肝癌裸鼠模型生物学特性的影响

前言

一、材料与仪器

二、方法

三、结果

四、讨论

第三部分 NC联合索拉非尼对肝细胞癌生物学特性影响机制的研究

前言

一、材料与仪器

二、方法

三、结果

四、讨论

全文总结

参考文献

综述 肿瘤干细胞与肝癌干细胞

硕士期间参与完成的文章

学术交流

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