来自角蛋白降解菌Stenotrophomonas maltophilia DHHJ的角蛋白酶的酶解研究及分离纯化

摘要

角蛋白作为一种硬性蛋白，具有不溶于水和抗分解的性质，一般条件下不溶解，且不能被一般的蛋白酶水解，这给角蛋白的处理提出了难题。我国的角蛋白资源极其丰富，如家禽羽毛、角蹄和皮革下脚料等，它们大部分没有被充分利用，有的甚至造成环境污染。而近年来畜牧业及氨基酸工业的大力发展使得蛋白资源极其紧缺，因此，研究有效的处理方法使废弃的角蛋白直接转变成蛋白质或复合氨基酸，使之能直接得到应用或作为进一步提纯氨基酸的廉价易得的原料，从而变废为宝，既保护环境又资源利用，还将具有十分显著的经济效益和社会效益。论文应用课题组分离得到的角蛋白降解菌嗜麦芽寡养单胞菌DHHJ(Stenotrophomonas maltophilia DHHJ)，研究该菌的角蛋白酶(粗酶)的酶解谱，然后纯化粗酶，获得了一种纯的角蛋白酶。 首先，我们选用几种常见的角蛋白废弃物，通过测定粗酶水解底物时的酶活性，对角蛋白降解菌的酶解谱进行研究。结果显示，同属于β角蛋白的鸡毛和鸽毛角蛋白，其降解的酶活性在其余各种角蛋白中最高，说明嗜麦芽寡养单胞菌DHHJ产生的酶对含β角蛋白的角蛋白材料的降解效果较好。另外，此菌也可降解a角蛋白，包括硬质角蛋白(牛角，羊角，指甲，羊蹄角)和羊毛、头发、牛毛等软质角蛋白。由嗜麦芽寡养单胞菌DHHJ所产角蛋白酶对各类角蛋白底物的降解，说明此角蛋白酶的酶解范围相当广泛，具有开发应用价值。 然后，课题研究了颜色在羽毛酶解过程中产生的作用。选择同一养殖场鸡群的三种不同颜色的羽毛，使各颜色的羽毛的长度和重量尽量相等，假定各种颜色的羽毛样品对酶和菌株的降解作用表面是相同的，分别以完整羽毛和羽毛粉作为研究对象。对不同颜色的羽毛的研究发现，只有当羽毛完整无破损时，颜色才对羽毛降解产生影响，且颜色越深降解效果越差，说明黑色素对羽毛降解的影响可能只是增加其结构上的优势，一旦羽毛经过粉碎，结构上的优势被打破，黑色素便无影响。这说明了在羽毛发酵前进行适当的处理是非常必要的，可以降低羽毛自身结构对降解产生的不利影响。 再后，论文根据现有实验室的实验条件，选择硫酸铵盐析、凝胶层析和CHT层析对角蛋白酶的粗酶进行了纯化。硫酸铵盐析时，在粗酶液中加入不同浓度的硫酸铵(W/V)，综合考虑比酶活和产率，认为10％的硫酸铵浓度得到的提纯结果是比较合适的，以此作为进一步提纯的起始步骤。在Sephadex G—100凝胶层析时，以pH7.5、0.2M的磷酸钠缓冲液作为平衡液和洗脱液，确定最适合的平衡和洗脱流速分别是0.5mL/min和0.4mL/min，上样量为0.5mL，收集管每管收集1mL，收集30管，样品就可以完全被洗脱下来。收集有酶活性的部分进行下一步的纯化。CHT层析时，选用单梯度洗脱，其半衡液(A液)：5mMPB，pH7.5；洗脱液(B液)：400mMPB，pH7.5；A液和B液中分别加入30mM NaCl以优化分离效果。平衡流速为0.5mL/min，上样量为1.4mL，沈脱条件为：A液洗脱2min，0％—100％B液洗脱4min，B液洗脱19min，流速1mL/min，每管收集1mL，共收集25管，即可将样品完全洗脱下来。经过多步纯化后，角蛋白的纯化倍数达到17.24。 利用SDS—PAGE验证角蛋白酶的纯化结果。浓缩胶5％、分离胶12％为此角蛋白酶电泳的最佳条件。变性和非变性的电泳条件的结果说明，此角蛋白酶是一种单纯酶，分子量大约为35.2kDa。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：主要缩略词表、图表目录

声明

1绪论

1.1角蛋白概述

1.1.1 角蛋白的结构和性质

1.1.2 角蛋白的应用

1.2微生物降解角蛋白

1.2.1 降解角蛋白的微生物的类群

1.2.2角蛋白酶的酶学性质

1.2.3角蛋白酶的分子生物学研究

1.2.4角蛋白降解的生化机制

1.2.5 角蛋白酶的应用研究现状及展望

1.3选题意义和主要内容

1.3.1选题意义

1.3.2实验主要内容

2角蛋白降解菌粗酶的酶解谱研究

2.1实验材料

2.1.1 供试细菌

2.1.2角蛋白粉

2.1.3约品与试剂

2.1.4仪器与设备

2.1.5培养基(W/V％)

2.2实验和分析方法

2.2.1 菌株复壮

2.2.2发酵培养条件

2.2.3粗酶液的提取

2.2.4不同角蛋白底物对酶活性的影响一酶解谱的研究

2.2.5 角蛋白酶活性的测定

2.3结果与讨论

2.3.1针对不同类型的角蛋白进行降解谱的实验结果

2.3.2实验结果讨论

2.4本章小节

3颜色对角蛋白降解的影响

3.1实验材料

3.1.1 供试细菌

3.1.2角蛋白粉

3.1.3药品与试剂

3.1.4仪器与设备

3.1.5培养基(W/V％)

3.2实验和分析方法

3.2.1发酵培养条件

3.2.2粗酶液的提取

3.2.3不同颜色羽毛对酶活性的影响

3.2.4.蛋白质含量的测定(考马斯亮监染色法)[113]

3.2.5角蛋白酶活性的测定

3.3结果与讨论

3.3.1 不同颜色的羽毛底物的酶解研究实验结果

3.3.2实验结果讨论

3.4本章小节

4角蛋白酶的纯化

4.1实验材料

4.1.1供试细菌

4.1.2角蛋白粉

4.1.3药品与试剂

4.1.4仪器与设备

4.1.5培养基(W/V％)

4.2实验和分析方法

4.2.1发酵培养条件

4.2.2粗酶液的提取

4.2.3硫酸铵盐析的原理和方法

4.2.4凝胶层析的原理和方法

4.2.5 CHT层析的原理和方法

4.2.6 SDS-PAGE的原理和方法

4.2.7蛋白质含量的测定(考马斯亮监染色法)

4.2.8角蛋白酶活性的测定

4.2.9角蛋白酶的N-端洲序

4.3实验结果与讨论

4.3.1硫酸铵粗提结果与讨论

4.3.2凝胶层析结果与讨论

4.3.3 CHT层析结果与讨论

4.3.4 SDS-PAGE结果与讨论

4.4本章小节

5结论与展望

5.1结论

5.2展望

参考文献

攻读学位期间发表的学位论文及专利申请

致 谢