大腹圆蛛基因组DNA文库构建及其拖丝蛋白基因的杂交筛选

摘要

蜘蛛属节肢动物门(Arthropoda)，是蛛形纲(Arachnoidea)中最大的一类，约36000种，我国已记录蜘蛛2361种。所有蜘蛛都能纺丝，蜘蛛丝是天然丝纤维中最细的丝，具有特殊的结构，在许多方面都表现出独特的优良品质，如强度大、弹性好、韧性强、耐冲击、耐疲劳，而且密度低、抗辐射，具有可湿性、耐火、耐热、耐低温，无论是在干燥状态还是潮湿状态都表现出很好的性能：由于蜘蛛丝是由蛋白质构成，具有生物可降解性，是可循环再生的材料，因而对环境是友好的。 由于蜘蛛具有同类相食的特性，难以密集饲养，限制了蜘蛛丝蛋白的广泛应用。因此，通过转基因技术大量获得蜘蛛丝已经成为当前生物学研究的主要目标。在我国，分布最广、蛛丝性能极佳的当属大腹圆蛛(Araneusventricosus)，虽然已有一些科研人员对其进行了研究，但还没有得到拖丝蛋白编码基因的全长序列。为了获得大腹圆蛛拖丝蛋白编码基因，本论文从以下方面进行研究： 首先，通过大量的对比实验，建立了适合蜘蛛基因组DNA的提取方法——尿素裂解法。该方法简单便捷，成本低，无需液氮研磨，可在常温下进行，裂解过程中不形成沉淀，呈悬浮状，不用颠倒混匀，避免了流体剪切力对高分子量DNA的剪切作用，完整性好，提取的DNA大小远在23kb以上，更适合高分子量基因组DNA的提取；DNA得率高，每毫克蜘蛛附肢肌肉可提取出150ng左右的高分子量基因组DNA，无蛋白质污染，满足分子生物学实验的要求。 将提取的基因组DNA随机断裂成约40kb的片段，经过末端补齐、5’端磷酸化后，用琼脂糖凝胶分离、纯化，连入CopyControlpCC2FOSTM载体，通过MaxPlaxTMLambdaPackagingExtracts包装，转入EPI300TM—TlRE．coli，成功构建了无偏向性、覆盖大腹圆蛛全部基因的Fosmid文库，其包装滴定度达8.0×104。根据已经公布的蜘蛛拖丝基因特征序列，设计并合成了位于拖丝蛋白N端、中间重复区和C端的特异性杂交引物，经[α-32P]dCTP标记后进行反复原位杂交。以中间重复区杂交引物重复杂交2次，在大约4.8×105个菌落中筛选出约1.3×103个阳性克隆；再以C端特异性杂交引物对上述1.3×103个阳性克隆进行杂交，得到82个清晰的阳性斑；最后，以N端特异性杂交引物在上述结果中筛选出12个阳性克隆。从理论上讲，这12个阳性克隆应该含有大腹圆蛛拖丝蛋白的全长编码基因，虽然杂交存在一定的假阳性，至少会包含部分编码基因，其它阳性克隆也会含有拖丝蛋白的部分编码基因。用鸟枪法随机测序，得到了4条具有典型拖丝蛋白重复序列(GAGA、GGX和GPGGY模体)的DNA片段，通过Blast工具在线分析，结果与已经公布的大腹圆蛛丝蛋白基因有90％以上的序列同源性。 通过本论文的研究，建立了尿素裂解法提取蜘蛛基因组DNA，解决了蜘蛛基因组DNA提取难题，成功构建了蜘蛛基因组DNAFosmid文库，获得了携带大腹圆蛛拖丝蛋白编码基因的阳性克隆，得到了拖丝蛋白编码基因新序列，对进一步深入研究和开发蜘蛛丝打下了良好的基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

第1章绪论

1.1引言

1.2蜘蛛丝的种类及其本质

1.3蜘蛛拖丝蛋白的结构及其优良品质

1.4蜘蛛拖丝蛋白的编码基因及其氨基酸序列特点

1.5蜘蛛丝蛋白的克隆表达

1.6蜘蛛丝蛋白的溶解和纺丝

1.7蜘蛛丝的应用前景

1.8课题研究的内容、目的和意义

第2章实验材料和设计方案

2.1实验材料和仪器

2.1.1蜘蛛、菌株和质粒载体

2.1.2酶与试剂

2.1.3主要仪器设备

2.1.4培养基和常用试剂的配制

2.2实验流程

第3章蜘蛛基因组DNA的提取

3.1蜘蛛的解剖

3.2蜘蛛基因组DNA的提取

3.2.1尿素裂解法

3.2.2.CTAB裂解法

3.2.3改进的基因组DNA提取试剂盒法

3.3品质鉴定

3.3.1电泳

3.3.2样本DNA纯度及含量的鉴定

4.1准备

4.2剪切基因组DNA

4.3剪切DNA的末端补齐

4.4.筛选末端补平的40 kb DNA片段

4.5回收40 kb DNA

4.6连接

4.7包装the CopyControl Fosmid Clones

4.8测定CopyControl Fosmid Clones的包装滴定度

第5章菌落原位杂交

5.1涂板与转膜

5.1.1大量细菌克隆的原位杂交筛选

5.1.2少量阳性克隆的进一步原位杂交筛选

5.2菌落的裂解和DNA与尼龙膜的结合

5.3寡核苷酸探针的放射性同位素标记和纯化

5.3.1用Exonuclease-free Klenow Fragment标记寡核苷酸探针

5.3.2用乙醇沉淀法纯化放射性标记的寡核苷酸探针

5.4杂交、洗膜与检测

5.4.1滤膜的预洗脱和预杂交

5.4.2杂交与洗膜

5.4.3杂交信号的分析和阳性克隆的鉴定

第6章质粒提取和测序

6.1活化单克隆、保留菌种

6.2诱导Fosmid阳性单克隆获得高拷贝

6.3质粒提取

6.4 电泳

6.5酶切分析

6.6测序

第7章结果与分析

7.1蜘蛛基因组DNA的提取

7.1.1三种提取方法的比较

7.1.2尿素裂解法提取蜘蛛基因组DNA的原理

7.1.3尿素裂解法提取蜘蛛基因组DNA的特点

7.2蜘蛛基因组DNA Fosmid文库构建

7.2.1大腹圆蛛基因组大小的确定

7.2.2计算所建文库应该出现的克隆数

7.2.3基因组DNA Fosmid文库的包装滴定度

7.2.4涂板量

7.3杂交筛选

7.3.1杂交引物的设计与标记原理

7.3.2杂交温度和洗膜温度

7.3.3探针浓度

7.3.4杂交结果

7.4质粒提取、酶切鉴定和测序

7.4.1诱导阳性单克隆获得高拷贝

7.4.2质粒提取

7.4.3酶切分析

7.4.4测序

第8章结论

8.1结论

8.2创新点

8.3展望

参考文献

硕士期间发表论文和参加科研情况说明

致谢