基于不同探针的几种持久性有毒污染物检测方法研究

摘要

持久性有毒污染物(Persistent Toxic Substances，PTS)与臭氧层破坏以及温室效应并称为21世纪影响人类生存与健康的三大环境问题。无论是《斯德哥尔摩公约》中确定的21类持久性有机污染物(Persistent Organic Pollutants，POPs)；还是美国EPA确定的12类持久性生物富集有毒化合物(Persistent Bioaccumulative& Toxic Chemicals，PBT)；以及环境内分泌干扰物(Environmental EndocrineDisruptors，EEDs)的研究都与持久性有毒化学污染物有关。
　　 多环芳烃(PAHs)和多氯联苯(PCBs)就是其中两类典型的持久性有毒污染物，它们在环境中分布广泛，但多是痕量的，并且不易分解，具有高脂溶性，水溶性低，易于生物富集，同时不仅具有“三致”毒性(致癌、致畸和致突变)，而且具有内分泌干扰作用。因此对环境生物及人类健康已经形成了不可估量的潜在威胁。
　　 加强对PTS的检测分析是进行环境风险评价及对它们实施防控的重要前提。目前，检测PAHs和PCBs常见的方法有气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)和气质联用技术(GC/MS)。但是这些仪器分析方法存在设备复杂、操作要求尤其是样品前处理要求苛刻、价格昂贵、测定周期长等缺陷，不适合于现场快速检测和大批量分析。因此发展有效的生物分析技术将是未来的发展方向。荧光免疫分析及荧光定量免疫PCR技术由于其高特异性和高灵敏性而无需复杂的前处理过程，是很有发展前景的检测分析方法。随着交叉学科的发展，作为在生物及医学领域广泛应用的这些免疫分析方法，目前已经被引入应用于环境监测分析领域。
　　 本论文拟选择荧光免疫分析技术和实时荧光定量免疫PCR技术对具有典型性和代表性的PTS-多氯联苯和多环芳烃，进行分析检测方法上的研究，为PTS的环境毒理研究和环境污染治理提供检测方法上的科学的参考依据。同时荧光标记物的性质是荧光法免疫分析技术的关键，本论文拟引用新型荧光探针-量子点和分子信标作为荧光免疫分析和实时荧光定量免疫PCR实验的荧光标记物质，从而改善传统荧光染料的高本底值，特异性差的特点，并提高灵敏度和准确性。
　　 本论文通过合成CdTe量子点和设计出针对pUC18具有特异性的分子信标，建立了基于CdTe量子点的荧光免疫测定技术和基于分子信标探针的实时荧光定量免疫PCR技术对几种多环芳烃和多氯联苯进行分析检测。本论文主要研究内容及结论分述如下：
　　 1、量子点CdTe的制备及条件优化：采用巯基乙酸为稳定剂，在96℃下回流4 h，就可以在水相中直接合成了水溶性的碲化镉(CdTe)纳米晶，其荧光量子产率最高可达66.92％。通过TEM和XRD衍射图谱对其进行表征，说明了制备的CdTe量子点具备良好的结构特性。实验优化得到了制备量子点的各种最佳条件。CdTe经过表面羧基修饰，具备了生物标记功能，通过分子偶联作用，可链接DNA、多肽以及相关环境持久性有机污染物的抗体或抗原，为CdTe作为标记探针在环境污染物分析中的应用奠定了基础。
　　 2、生物素化探针DNA的制备和纯化：探针DNA是以pUC18质粒为模板扩增得到的一段123个碱基对的生物素化DNA。根据DNA扩增试剂盒的说明，在PCR扩增体系中加入各种反应物，包括两条生物素化了的引物。引物序列分别是：上游引物序列从5’到3’是CTGACTCCCCGTCGTGTAGA，下游引物的序列从5’到3’是GCTGGCTGGTTTATTGCTGAT。PCR扩增的程序是：94℃预变性4min；30个循环：每个循环94℃变性20 s，55℃退火20 s，72℃延伸20s；最后再72℃保持3 min使延伸完全。使用UNIQ-10 PCR纯化试剂盒，对PCR扩增产物进行纯化后，再用琼脂糖凝胶电泳后染色进行定性，并用紫外分光光度法定量检测分析。
　　 3、分子信标的设计与合成：依据分子信标探针设计原则，设计合成了针对pUC18 DNA具有特异性的分子信标探针，其序列为：5’-FAM-CAGCGATCTGGCCCCAGTGCTGCAATCGCTG-DABCYL-3’。通过特异性考察实验，结果表明该分子信标探针能特异识别反应体系中的DNA，为避免PCR体系的非特异扩增，降低本底值，提高灵敏度和准确性奠定了良好基础。
　　 4、直接竞争荧光免疫分析：以CdTe作为荧光标记物，在优化标记条件基础上，成功标记了抗萘、抗荧蒽和抗PCB12抗体，制成了相关的荧光免疫标记试剂。将这些标记试剂运用于对应污染物的荧光免疫检测分析(FIA)。通过考察包被介质、包被时间、离子强度、pH值、表面活性剂、抗原抗体最佳工作浓度等影响因素，得到了直接竞争FIA的优化条件，由此建立的三种污染物的直接竞争FIA抑制率标准曲线，得到线性范围为10-2-103ng/mL，检测萘、荧蒽和PCB12得到的检出限：IC20分别为7.384pg/mL、9.046 pg/mL和8.186 pg/mL。该方法成功应用于环境样品的检测，并考察了方法的特异性、回收率、精密度，结果较满意。
　　 5、抗体包被荧光免疫分析：以CdTe作为荧光标记物，在优化标记条件基础上，成功标记了萘、荧蒽和PCB12完全抗原，制成了相关的荧光免疫标记试剂。将这些标记试剂运用于对应污染物的荧光免疫检测分析(FIA)。通过考察包被介质、包被时间、离子强度、pH值、表面活性剂、抗原抗体最佳工作浓度等影响因素，得到了抗体包被FIA的优化条件，由此建立的三种污染物的抗体包被FIA抑制率标准曲线，得到线性范围为10-2-103 ng/mL，检测萘、荧蒽和PCB12得到的IC20分别为13.95 pg/mL，15.94 pg/mL和12.94 pg/mL。该方法成功应用于环境样品的检测，并考察了方法的特异性、回收率、精密度，结果较为满意。
　　 6、直接竞争实时荧光定量免疫PCR：以分子信标作为荧光探针，运用直接竞争实时荧光定量免疫聚合酶链式反应(直接竞争RTFQ-IPCR)分析方法检测环境中多环芳烃类污染物-萘、蒽和荧蒽。用制备好的包被原包被经过戊二醛处理过的PCR管，然后用PAHs与包被原竞争结合生物素化抗体，再利用亲和素连接生物素化抗体和生物素化DNA，最后通过实时定量PCR仪，在优化的扩增程序下扩增DNA并实现实时定量检测。论文建立了直接竞争RTFQ-IPCR方法的标准曲线，对萘、蒽和荧蒽三种污染物进行检测，得到线性范围分别为1-104fg/mL、10-105fg/mL和10-107fg/mL，相关性较好，检出限分别为0.81、5.94、3.84fg/mL。该方法应用于实际环境样品的分析，并考察了方法的特异性、回收率，结果令人满意。实际样品分析结果与ELISA测定结果进行比较，具有较好的一致性，表明所建立的方法对环境持久性有毒污染物的检测分析是可行的有效的。
　　 7、间接竞争实时荧光定量免疫PCR：以分子信标作为荧光探针，运用间接竞争实时荧光定量免疫聚合酶链式反应(间接竞争RTFQ-IPCR)分析方法检测环境中多环芳烃类污染物-菲。用制备好的包被原包被经过戊二醛处理的PCR管，然后用待测物菲与包被原竞争结合一抗，接着利用生物素化二抗与结合在包被原上的特异性一抗结合，再利用亲和素连接生物素化抗体和生物素化DNA，最后通过实时定量PCR仪，在优化的扩增程序下扩增DNA并实现实时定量检测。论文建立了间接竞争RTFQ-IPCR分析方法标准曲线，对污染物菲进行检测，得到线性范围为10-106fg/mL，检出限为5.34 fg/mL，相关系数为0.9747。应用于实际环境样品的分析，并考察了方法的特异性及样品回收率，结果满意。实际样品检测结果与HPLC测定结果比较发现两者相差不大，在误差范围内是可以接受的。
　　 8、抗体包被实时荧光定量免疫PCR：以分子信标作为荧光探针，运用固相抗体包被实时荧光定量免疫聚合酶链式反应(抗体包被RTFQ-IPCR)分析方法检测环境中多氯联苯类污染物-PCB77。用制备好的包被抗体包被经过戊二醛处理的PCR管，然后用待测污染物PCB77小分子和生物素化半抗原竞争结合包被抗体，再利用亲和素连接生物素化半抗原和生物素化的DNA，最后通过实时定量PCR仪，在优化的扩增程序下扩增DNA并实现实时定量检测。论文建立了抗体包被RTFQ-IPCR分析方法标准曲线，对污染物PCB77进行检测，得到线性范围为10-105fg/mL，检出限为6.63fg/mL，相关系数为0.9972。应用于实际环境样品的分析，并考察了方法的特异性及样品回收率，结果令人满意。实际样品检测结果与GC/MS测定结果比较发现两者相关性较好，在误差范围内存在的差异是可以接受的。
　　 本论文首次成功的将CdTe量子点和分子信标探针分别作为荧光免疫分析方法和实时荧光定量免疫PCR方法的荧光标记探针对多环芳烃和多氯联苯污染物进行了检测分析，结果满意可靠，为环境中痕量的持久性有毒污染物的检测分析，提供了新的研究思路。

目录

文摘

英文文摘

第一章 绪论

1.1 课题研究背景

1.1.1 持久性有毒污染物概述

1.1.2 多氯联苯类持久性有毒污染物概述

1.1.3 多环芳烃类持久性有毒污染物概述

1.1.4 荧光免疫分析技术概述

1.1.5 量子点的应用研究概述

1.1.6 实时荧光定量免疫PCR技术研究概述

1.1.7 分子信标的应用研究概述

1.2 课题的研究目的及意义

1.3 课题的研究内容、技术路线和方法及创新点

1.3.1 研究内容

1.3.2 技术路线图

1.3.3 创新点

第二章 CDTE量子点的合成及条件优化

2.1 引言

2.2 实验部分

2.2.1 主要试剂和仪器

2.2.2 碲化镉纳米晶的合成

2.3 结果与讨论

2.3.1 CdTe纳米晶的结构表征

2.3.2 实验条件的优化

2.3.3 CdTe真空干燥后样品

2.4 本章小结

第三章 基于量子点探针的直接竞争荧光免疫测定环境持久性有毒污染物

3.1 引言

3.2 实验仪器、材料与试剂

3.2.1 实验仪器

3.2.2 实验材料及试剂

3.3 实验部分

3.3.1 CdTe标记荧蒽(萘、PCB12)抗体荧光免疫试剂的制备

3.3.2 功能性CdTe量子点与抗荧蒽抗体的结合比例实验

3.3.3 量子点标记抗体的性能鉴定

3.3.4 直接竞争FIA一般步骤及实验原理

3.3.5 直接竞争FIA分析方法的条件优化

3.3.6 基于CdTe量子点的直接竞争FIA法标准曲线的建立

3.3.7 直接竞争FIA分析方法特异性评价

3.3.8 直接竞争FIA分析方法实际环境样品的测定和加标回收率

3.3.9 精密度实验

3.4 结果与讨论

3.4.1 CdTe的体积与浓度和不同抗体的最佳结合比

3.4.2 CdTe标记抗荧蒽抗体的标记时间考察

3.4.3 荧光免疫试剂标记性能的鉴定

3.4.4 荧光免疫试剂的稳定性

3.4.5 标记试剂的荧光光谱和紫外吸收光谱

3.4.6 抗原抗体最佳工作浓度的确定

3.4.7 实验条件优化

3.4.8 萘、荧蒽及PCBl2的直接竞争FIA标准曲线及实际样品分析

3.4.9 基于量子点的直接竞争FIA法与直接竞争ELISA方法的比较分析

3.4.10 基于量子点的荧光免疫分析的创新意义

3.5 本章小结

第四章 基于量子点探针的抗体包被荧光免疫测定环境持久性有毒污染物

4.1 引言

4.2 实验仪器、材料和试剂

4.2.1 实验仪器

4.2.2 实验材料及试剂

4.3 实验部分

4.3.1 CdTe标记萘(荧蒽、PCB12)抗原荧光免疫试剂的制备

4.3.2 功能性CdTe量子点与萘(荧蒽、PCB12)-OVA的结合比例实验

4.3.3 量子点标记抗原的性能鉴定

4.3.4 抗体包被竞争FIA检测方法的建立

4.3.5 抗体包被FIA分析方法的条件优化

4.3.6 抗体包被FIA分析方法标准曲线的建立

4.3.7 实际环境样品的测定和加标回收实验

4.3.8 精密度实验

4.3.9 抗体包被FIA分析方法特异性评价

4.4 结果与讨论

4.4.1 CdTe与萘(荧蒽、PCB12)半抗原的最佳结合比例

4.4.2 荧光免疫试剂的性能的鉴定及稳定性分析

4.4.3 标记试剂的荧光光谱和紫外吸收光谱

4.4.4 抗体包被FIA条件的优化

4.4.5 萘、荧蒽及PCB12的抗体包被FIA分析方法标准曲线及实际样品测定

4.5 基于量子点的抗体包被FIA法与抗体包被ELISA方法的比较分析

4.6 本章小结

第五章 基于分子信标探针的直接竞争实时荧光定量免疫PCR测定环境持久性有毒污染物

5.1 引言

5.2 生物素化DNA的合成

5.2.1 生物素化引物及其设计

5.2.2 生物素化引物的扩增

5.2.3 生物素化DNA纯化

5.3 分子信标的设计与合成

5.4 基于分子信标探针的直接竞争FQRT-IPCR实验原理

5.5 仪器、材料及试剂

5.5.1 仪器

5.5.2 材料及试剂

5.6 实验部分

5.6.1 分子信标的特异性考察

5.6.2 直接竞争FQRT-IPCR分析方法的条件优化

5.6.3 直接竞争FQRT-IPCR分析方法标准曲线的建立

5.6.4 直接竞争RTFQ-IPCR分析方法实际样品的测定和加标回收实验

5.6.5 直接竞争FQRT-IPCR分析方法特异性评价

5.7 结果与讨论

5.7.1 生物素化DNA的鉴定

5.7.2 分子信标特异性分析

5.7.3 基于分子信标的直接竞争RTFO-IPCR条件优化

5.7.4 基于分子信标的直接竞争FQRT-IPCR分析方法标准曲线及实际样品的测定

5.8 本章小结

第六章 基于分子信标探针的菲的间接竞争实时荧光定量免疫PCR检测方法研究

6.1 引言

6.2 实验仪器及材料

6.2.1 实验仪器

6.2.2 实验材料及试剂

6.3 实验方法

6.3.1 间接竞争FQRT-IPCR分析方法的条件优化

6.3.2 基于分子信标的间接竞争RTFQ-IPCR分析方法标准曲线的建立

6.3.3 间接竞争FQRT-IPCR分析方法实际环境样品的测定和加标回收率

6.3.4 间接竞争FQRT-IPCR分析方法特异性评价

6.4 结果与讨论

6.4.1 实验条件的优化

6.4.2 基于分子信标的菲的间接竞争FQRT-IPCR标准曲线及实际样品的测定

6.5.3 方法的特异性分析

6.5.4 间接竞争RTFQ-IPCR与HPLC结果比较分析

6.6 本章小结

第七章 基于分子信标探针的PCB77的抗体包被实时荧光定量免疫PCR检测方法研究

7.1 引言

7.2 抗体包被RTFQ-IPCR检测方法的基本原理

7.3 实验仪器及材料

7.3.1 实验仪器

7.3.2 实验材料及试剂

7.4 实验方法

7.4.1 抗体包被RTFQ-IPCR分析方法的条件优化

7.4.2 抗体包被RTFQ-IPCR分析方法标准曲线的建立

7.4.3 抗体包被RTFQ-IPCR分析方法实际环境样品的测定和加标回收率

7.4.4 抗体包被RTFQ-IPCR分析方法特异性评价

7.5 结果与讨论

7.5.1 实验条件的优化

7.5.2 基于分子信标的抗体包被FQRT-IPCR分析方法标准曲线及实际样品的测定

7.5.3 抗体包被RTFQ-IPCR与GC/MS结果比较分析

7.5.4 方法的特异性分析

7.5.5 基于分子信标的抗体包被RTFQ-IPCR方法

7.6 本章小结

第八章 结论与展望

8.1 结论

8.2 展望

参考文献

攻读博士期间已发表和未发表的论文

致谢