构建及筛选S1型断裂蛋白质内含子用于蛋白质定点标记

摘要

蛋白质内含子是位于宿主蛋白质中的插入序列，在蛋白成熟过程中自我去除，并以肽键连接两侧的宿主蛋白质序列(称为蛋白外显子)，蛋白质这一成熟过程被称为蛋白质剪接。断裂蛋白质内含子是指蛋白质内含子被分裂成两部分即N端区域(IN)和C端区域(IC)，分别由不同的开放阅读框表达。断裂蛋白质内含子的独特性是能够分段表达或合成，并且能够特异性识别，为蛋白质合成和修饰提供了新的途径，因而在蛋白质工程及其它领域具有广泛的应用前景。
　　 在蛋白质标记领域，应用新型断裂蛋白质内含子对目的蛋白特异位点进行修饰或标记，有助于更深入地研究目的蛋白的结构和功能。目前在蛋白质标记领域中所采用的是人工构建的断裂蛋白质内含子，该方法用于定点标记的局限性在于：(1)异源宿主中蛋白质剪接效率可能大大降低甚至不能发生剪接反应，并且其剪接需要的蛋白质外显子的氨基酸也是特定的，限制了蛋白质内含子的应用范围；(2)大片段的断裂蛋白质内含子与目的蛋白进行融合表达，这样可能造成目的蛋白可溶性的改变或其它不可知的影响；(3)人工合成小肽增加了实验成本等。
　　 为克服上述局限性，本课题构建6个新型的S1型断裂蛋白内含子，将其C端半胱氨酸突变为丝氨酸，并且将两侧的天然外显子替换为一段通用性高的连接小肽(GG-SAG)，对新型断裂蛋白质内含子体内和体外的剪接活性进行检测，筛选出合适的断裂蛋白质内含子进行应用。
　　 本文利用实验室已有的微小蛋白质内含子进行改造，成功构建了6个C端无半胱氨酸的S1型断裂蛋白质内含子(称为CF-intein)，通过对体内剪接活性的分析，筛选出3个具有相对较高剪接活性的断裂蛋白质内含子(CFRBS1，CFTXS1和CFSXS1)进行体外剪接活性检测。结果分析表明：CFRBS1 intein具有较稳定的剪接活性，较高的剪接活性以及较快的剪接速率；同时模式蛋白的标记检测结果也显示，CFRBS1 intein可进行蛋白质定点标记应用。
　　 本课题中期望改造后的S1型断裂蛋白质内含子在进行应用时，特异性较高，不仅可以带上荧光基团、标签等，对于富含半胱氨酸的蛋白也能进行定点标记，并且不需要对目的蛋白进行突变或其它改造。由于C端不含有半胱氨酸，能够避免蛋白质内含子与目的蛋白的巯基形成二硫键。同时所构建的蛋白质内含子的两边已经不是其天然蛋白质外显子，替换成一段连接小肽，这样可以提高其通用性，利于蛋白质工程的实际应用。本课题不仅仅是对前人的研究作为一个补充，更为提高蛋白质内含子在异源蛋白中的适应能力，为拓宽其应用范围打下坚实的基础。