树状大分子衍生物及其纳米颗粒复合物的表面修饰及其对PCR的优化研究

摘要

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一种在体外模拟体内DNA复制的核酸扩增技术。在过去的20多年，PCR技术发展迅速，一系列的PCR相关技术被设计出，并广泛的应用在遗传学、生物医学等众多领域，已然成为现代生物学实验室最基本的实验技术之一。但是PCR技术遇到的瓶颈问题影响其进一步的应用，例如特异性问题，因此亟待寻找解决这些问题的方法。纳米材料因其独特的理化性质而越来越多的被研究者应用到PCR反应中，这为改善PCR技术打开了新的思路，大大拓宽了PCR技术的应用范围。
　　 本论文基于课题组前期的研究工作，将不同表面修饰的树状大分子及其金属纳米复合物作为新型PCR添加剂，研究其表面电荷、结构和抗蛋白吸附性质在优化PCR的效率和特异性方面的作用，并探讨其可能存在的作用机制。
　　 本研究建立了三套PCR测试体系用来检测添加剂对PCR的优化作用。一套是以小鼠尾基因组为模板的非特异性扩增体系，一套是以绿脓杆菌基因组(Pseudomonas aeruginosa，PA)为模板的二次扩增非特异性体系，一套是以λDNA为模板的三次扩增非特异性体系。我们首先将不同表面基团修饰（聚乙二醇和/或乙酰基修饰）的包裹/未包裹金属纳米颗粒的树状大分子加入到小鼠尾基因组体系和PA体系，实验结果显示这些添加剂对PCR体系均有优化效果。树状大分子包裹纳米金颗粒之后优化PCR的效果更好，并且PEG抗蛋白吸附的抑制作用因包裹纳米金颗粒而明显削弱。表面几乎不带电荷的G5.NHAc-mPEG和{(Au0)300-G5.NHAc-mPEG}以及G5.NH2优化PCR的最优浓度相差1000倍左右，表明当纳米材料与PCR组分间的静电相互作用比较弱时，纳米金颗粒的热传导性能可能在优化PCR时起了重要作用。即未包裹纳米金颗粒的情况下，树状大分子与PCR组分间的相互作用在优化PCR时起了重要作用，包裹纳米金颗粒的情况下，纳米金颗粒的导热性能在优化PCR时起重要作用。
　　 我们将不同表面基团修饰（聚乙二醇和/或乙酰基修饰）的包裹纳米银颗粒的树状大分子加入到λDNA的三轮扩增体系中，发现这些材料都具有PCR优化效果，并且随着银含量的增加，材料具有更强的优化能力。在纳米银颗粒含量相同的情况下，表面带正电荷的树状大分子的优化能力要明显强于表面电荷为零的树状大分子。这就表明树状大分子与PCR组分间表面静电作用以及纳米银颗粒的热传导性能在优化PCR时可能同时起了作用，其中静电相互作用起了关键作用。
　　 值得提出的是，在本论文中，我们将G5.NHAc-mPEG和{(Au0)300-G5.NHAc-mPEG} DENPs两种材料分别加入到三套PCR体系中进行优化，结果发现两种材料在三个测试体系中具有相近的最优浓度和浓度差异，这表明树状大分子衍生物及其纳米复合物可以作为一种高效、稳定的PCR添加剂适用于不同的PCR体系。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 聚合酶链式反应概述

1．1．1 PCR技术基本原理

1．1．2 PCR的应用

1．2 PCR优化方法

1．2．1 调整反应条件

1．2．2 加入添加物

1．2．3 采取不同的PCR策略

1．3 纳米材料

1．3．1 纳米材料在生物医学中的应用

1．3．2 树状大分子

1．3．3 树状大分子的应用

1．4 纳米材料在PCR应用中的研究进展

1．4．1 PCR优化用纳米材料

1．4．2 纳米PCR反应特性

1．4．3 纳米材料优化PCR反应机制的研究进展

1．5 本论文的研究方向及研究意义

第二章 不同表面修饰的树状大分子及其纳米金复合物对小鼠Thy-1基因体系和PA体系的优化作用

2．1 引言

2．2 实验材料和方法

2．2．1 实验仪器和设备

2．2．2 PCR添加剂

2．2．3 实验试剂

2．2．4 Au DENPs的合成

2．2．5 Au DENPs的表征

2．2．6 PCR测试体系

2．2．7 引物合成及配制

2．2．8 纳米材料悬浮液的配制和用量优化

2．2．9 PCR产物的检测和定量

2．2．10 粒径和Zeta电势的测定

2．2．11 紫外吸收光检测

2．3 实验结果与讨论

2．3．1 {(Au0)300-G5．NH2-mPEG}DENPs的尺寸和紫外吸收光谱

2．3．2 扩增前后Au DENPs的稳定性测试

2．3．3 小鼠Thy-1基因体系的构建

2．3．4 树状大分子及其衍生物对小鼠Thy-1基因体系的作用

2．3．5 树状大分子金属纳米复合物对小鼠Thy-1基因体系的作用

2．3．6 材料的电势和扩增前后粒径测试

2．3．7 PA体系的构建

2．3．8 添加剂对PA基因体系的作用

2．4 本章小结

第三章 包裹银纳米颗粒的树状大分子及其衍生物对三轮PCR扩增体系的作用

3．1 引言

3．2 实验材料和方法

3．2．1 实验仪器和设备

3．2．2 PCR添加剂

3．2．3 实验试剂

3．2．4 Ag DENPs的合成

3．2．5 Ag DENPs的TEM表征

3．2．6 PCR测试体系

3．2．7 引物合成及配制

3．2．8 纳米材料悬浮液的配制和用量优化

3．2．9 PCR产物检测方法

3．3 结果与讨论

3．3．1 Ag DENPs的TEM表征

3．3．2 三轮PCR扩增体系的构建

3．3．3 包裹银纳米颗粒的树状大分子及其衍生物对三轮PCR扩增体系的作用

3．3．4 不同含量银的纳米颗粒对三轮PCR扩增体系的作用

3．3．5 G5．NHAc-mPEG，{(Au0)300-G5．NHAc-mPEG}对三轮PCR扩增体系的作用

3．4 本章小结

第四章 结论与展望

4．1 结论

4．2 展望

参考文献

攻读硕士期间发表论文

致谢