锂皂石或羟基磷灰石掺杂的静电纺纳米纤维的生物医学应用研究

摘要

静电纺纳米纤维具有极高的比表面积、高孔隙率和互通的三维网状结构，可模拟天然细胞外基质的结构特点。由于具备主体高分子和客体引入物的双重性质，有机/无机复合纳米纤维激起了科研工作者们浓厚的兴趣。聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)具有良好的细胞相容性和生物降解性。γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是由微生物合成的一种天然高分子材料，具有良好的细胞相容性和生物降解性。本文以上述两种高分子材料为主体，制备了基于上述两种高分子物质的有机或有机/无机复合纳米纤维，研究了这些静电纺纳米纤维的生物相容性、载药和释药以及细胞生物响应规律，探讨了它们作为组织工程支架材料或药物载体材料的应用前景。
　　 据文献报道，LAP具有“类三明治”的立体结构，这一结构使其具有容纳其他小分子物质的能力。本文第二章选择LAP作为抗肿瘤药物阿霉素盐酸盐(DOX)的载体，通过物理搅拌的方式直接获得负载有DOX的LAP/DOX纳米颗粒，评价了LAP/DOX纳米颗粒对DOX的释放特性和体外抗肿瘤活性。结果表明:当LAP和DOX的浓度分别为3mg/mL和1mg/mL时，LAP对DOX的负载效率可以高达98.3(±)0.77％。X-射线衍射(XRD)分析结果证明DOX主要通过与LAP(001)晶面相互作用的方式负载于LAP的内部空腔中。LAP/DOX对DOX的释放显示出pH依赖性:在正常的生理条件下(pH=7.4)，DOX的释放速率较慢;而在弱酸性条件下（模拟肿瘤环境，pH=5.4）释放较快。抗癌活性评价结果表明，和纯DOX相比，LAP/DOX能更有效地抑制人口腔上皮癌细胞（KB细胞）的增殖。
　　 本文第三章通过静电纺丝制备出了不同比例锂皂石(LAP，1wt.‰3wt.％和5wt.％)掺杂的PLGA/LAP纳米纤维，研究了掺杂的LAP对纤维表面亲水性能、机械性能和细胞相容性的影响。结果表明:掺杂的LAP可以降低PLGA纳米纤维的直径和孔隙率，提高其机械性能、表面亲水性能和蛋白质吸附性能。所得的PLGA/LAP复合纳米纤维具有良好的细胞相容性和血液相容性。许多研究证明了含硅粘土在体外培养的条件下可以诱导人骨髓间充质干细胞(hMSC)的成骨分化。本章探究了PLGA/LAP复合纳米纤维在体外培养条件下诱导骨髓间充质干细胞成骨分化的能力。使用刃天青还原法分析了hMSC在PLGA/LAP纳米纤维表面的增殖能力;通过检验单个hMSC产生的碱性磷酸酶、细胞外骨钙素以及组织化学分析系统地评价了hMSC在PLGA/LAP纳米纤维表面培养21d后成骨分化情况。结果表明，hMSC在PLGA/LAP复合纳米纤维表面可以正常增殖。在生长培养基中(不含地塞米松(DEX))，纯PLGA纳米纤维不能诱导hMSC成骨分化，而在PLGA/LAP复合纳米纤维表面培养的hMSC却发生了成骨分化，表明掺杂的少量LAP可以促进hMSC的成骨分化，这对PLGA及其复合纳米纤维在骨组织工程领域的应用具有重要指导意义。
　　 在第二章和第三章的研究基础上，本文第四章选用阿莫西林（AMX）为模型药物，将AMX负载于LAP片层中，然后将制备的LAP/AMX分散于PLGA纺丝液中，利用静电纺丝制备出PLGA/LAP/AMX复合纳米纤维。研究了PLGA/LAP/AMX纳米纤维对AMX的释放动力学，评价了PLGA/LAP/AMX纳米纤维的细胞相容性和抗菌性能。结果表明:LAP可以成功地负载AMX，最优负载效率为9.76(±)0.57％。AMX从PLGA/LAP/AMX纳米纤维中的释放可以分为先快速释放后持续释放的两个阶段。PLGA/LAP/AMX载药纳米纤维在固体培养基和液体培养基中均可以有效地抑制金黄色葡萄球菌的生长。3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐比色法结果证明PLGA/LAP/AMX载药纳米纤维具有良好的细胞相容性，在伤口敷料领域具有潜在的应用价值。
　　 本文第五章分析了不同参数对静电纺制备γ-PGA纳米纤维形貌的影响机理，得到了一组最优的制备γ-PGA纳米纤维的工艺参数。通过改变γ-PGA纺丝液中三氟乙酸的质量分数，实现了对γ-PGA纳米纤维形貌的可控制备。在1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺耦合作用下，将γ-PGA纳米纤维表面的羧基与胱胺二盐酸盐或第二代聚酰胺-胺树状大分子(G2.NH2)进行酰胺化反应，实现了对γ-PGA纳米纤维的水稳定性处理。细胞实验结果表明制备的γ-PGA纳米纤维具有良好的细胞相容性，在组织工程等领域具有潜在的应用前景。
　　 本文第六章选用另外一种常用的无机纳米颗粒-纳米羟基磷灰石(n-HA)，分别用化学方法和物理方法制备出了n-HA复合材料。化学方法系首先在n-HA表面链接一层氨丙基三乙氧基硅烷(APTS)，在APTS氨基的介导作用下实现对n-HA表面的乙酰化和羧基化修饰。物理方法系将n-HA均匀分散到γ-PGA纺丝液中，通过静电纺丝法制备出γ-PGA/n-HA复合纳米纤维。结果表明:可以通过APTS的介导作用实现对n-HA表面的乙酰基或羧基化修饰。除了n-HA-APTS外，表面修饰有乙酰基和羧基的n-HA均具有良好的细胞相容性和血液相容性。n-HA对γ-PGA纳米纤维形貌无明显的影响;纺丝液中的三氟乙酸不会破坏n-HA的化学结构。本文的研究内容对有机、无机/有机复合纳米纤维在组织工程、药物载体等领域的研究具有重要的借鉴意义。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 引言

1．1．1 纳米技术和纳米材料

1．1．2 纳米纤维及其制备方法

1．2 静电纺丝技术的基本理论

1．2．1 静电纺丝技术

1．2．2 影响高聚物纳米纤维形貌的因素

1．3 有机及无机／有机复合纳米纤维

1．3．1 有机纳米纤维

1．3．2 无机／有机复合纳米纤维

1．4 静电纺纳米纤维的生物医学应用

1．4．1 组织工程支架材料

1．4．2 药物载体

1．5 本文的研究内容及创新性

1．5．1 研究内容

1．5．2 创新性

参考文献

第二章 LAP对DOX的负载及其抗肿瘤活性研究

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 材料和仪器

2．2．2 LAP／DOX载药体系的制备方法与条件优化

2．2．3 载药体系的表征

2．2．4 体外释放实验

2．2．5 LAP／DOX的体外抗癌活性评价

2．2．6 流式细胞技术

2．2．7 激光共聚焦显微镜成像

2．2．8 数据分析

2．3 结果与讨论

2．3．1 载药体系优化

2．3．2 FTIR和UV-Vis结果与分析

2．3．3 LAP负载DOX的机理

2．3．4 体外释放结果与讨论

2．3．5 LAP／DOX的抗肿瘤活性评价

2．3．6 细胞吞噬结果与讨论

2．4 本章小结

参考文献

第三章 PLGA／LAP复合纳米纤维的制备及其对hMSC成骨分化的影响

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 实验材料

3．2．2 静电纺PLGA／LAP纳米纤维的制备

3．2．3 测试与表征

3．2．4 PLGA／LAP纳米纤维的细胞相容性评价

3．2．5 PLGA／LAP纳米纤维的血液相容性评价

3．2．6 hMSC的培养与接种

3．2．7 PLGA／LAP复合纳米纤维对hMSC增殖的影响

3．2．8 碱性磷酸酶(ALP)和脱氧核糖核酸(DNA)含量分析

3．2．9 细胞外基质中骨钙素含量分析

3．2．10 钙离子含量分析

3．2．11 组织化学分析

3．3 结果与讨论

3．3．1 PLGA／LAP纳米纤维的性能表征

3．3．2 PLGA／LAP纳米纤维的细胞相容性评价

3．3．3 PLGA／LAP纳米纤维的血液相容性评价

3．3．4 PLGA／LAP复合纳米纤维对hMSC增殖的影响

3．3．5 ALP活性和DNA含量分析

3．3．6 细胞外基质中骨钙素含量分析

3．3．7 钙离子含量分析

3．3．8 组织化学分析

3．4 本章小结

参考文献

第四章 基于PLGA／LAP复合纳米纤维的载药系统的制备及应用研究

4．1 引言

4．2 实验部分

4．2．1 实验材料

4．2．2 LAP／AMX载药体系的构建

4．2．3 PLGA／LAP／AMX双载药体系的构建

4．2．4 测试与表征

4．2．5 药物释放动力学评价

4．2．6 释放药物的药效评价

4．3 结果与讨论

4．3．1 LAP／AMX载药体系的构建及表征

4．3．2 PLGA／LAP双载药体系的表征

4．3．3 PLGA／LAP双载药体系的细胞相容性性评价

4．3．4 PLGA／LAP双载药体系的药物释放动力学及缓释机理探究

4．3．5 PLGA／LAP双载药体系的体外抑菌活性评价

4．4 本章小结

参考文献

第五章 γ-PGA纳米纤维的制备、形貌控制及其细胞相容性评价

5．1 引言

5．2 实验部分

5．2．1 实验材料

5．2．2 γ-PGA纳米纤维的制备

5．2．3 静电纺γ-PGA纳米纤维的疏水化处理

5．2．4 测试与表征

5．2．5 静电纺γ-PGA纳米纤维的细胞相容性评价

5．3 结果与讨论

5．3．1 静电纺制备γ-PGA纳米纤维工艺条件的优化及机理研究

5．3．2 水稳定性γ-PGA纳米纤维的制备

5．3．3 γ-PGA纳米纤维的细胞相容性评价

5．4 本章小结

参考文献

第六章 n-HA的表面修饰及γ-PGA／n-HA纳米纤维的制备

6．1 引言

6．2 实验部分

6．2．1 实验材料

6．2．2 n-HA的表面修饰

6．2．3 测试与表征

6．3 结果与讨论

6．3．1 n-HA的表面修饰

6．3．2 静电纺γ-PGA／n-HA纳米纤维的表征

6．3．3 表面修饰后n-HA的细胞相容性评价

6．3．4 表面修饰后n-HA的血液相容性评价

6．4 本章小结

参考文献

第七章 结论与展望

7．1 本文的主要结论

7．2 展望

攻读博士期间发表论文、申请专利及获奖情况

致谢