三种天然产物中生物碱类化合物的液质联用分析

摘要

本课题从六个方面阐述了生物碱类化合物有效成分的药理作用，评述了目前生物碱类有效成分的提取分离技术，指出了不同提取方法的优缺点，综述了生物碱类有效成分的分析研究现状，比较了不同检测方法的特点，指出了目前检测方法的不足。
　　 针对目前生物碱类药物有效成分的检测现状，依据生物碱类药物有效成分的结构特征，本课题集高效能、高分辨的高效液相色谱分离技术与高灵敏度、高选择性的质谱检测技术于一体，建立了三种天然产物中生物碱类化合物的高效液相色谱-电喷雾电离-质谱联用(HPLC-ESI-MS/MS)分析方法，该法灵敏度高，选择性好，可用于生物碱类天然产物的有效质量监控。
　　 本课题详细考察了三种天然产物中生物碱类化合物的色谱分离及质谱分析检测的最佳条件。通过对固定相、流动相、柱温和流速的研究，优化了色谱分离条件。通过对离子化模式、喷雾针电压、干燥气温度、干燥气压力、毛细管电压和碰撞能量的研究，得到了最佳的质谱条件，最终建立的相应生物碱类化合物分离分析方法如下:
　　 1.黄连中生物碱的研究。目的:建立高效液相色谱-电喷雾离子-质谱联用技术同时测定药根碱，巴马亭，黄连碱和小檗碱的新方法。方法:实验采用Ultimate XB-C18色谱柱(150 mm×2.1 mm，3μm)，流动相:10mM乙酸铵水溶液（2％乙酸）-乙腈，梯度洗脱;流速:0.2mL·min-1;柱温:35℃;质谱条件为:电喷雾电离源(ESI);正离子扫描;多反应监测模式（MRM）;喷雾针电压:4500 V;干燥气温度:300℃;干燥气压力:35 psi;碰撞气(Ar)压力:1.5mT。结果:在最佳实验条件下，药根碱、黄连碱、巴马亭和小檗碱实现了基线分离。在正离子模式下，根据化合物准分子离子峰和碎片离子峰，鉴定了化合物的结构。其中，准分子离子峰分别为m/z=339.1、320.9、353.1和337，定量离子峰分别为m/z=322、292、337和320，在最佳实验条件下，药根碱、黄连碱、巴马亭和小檗碱分别在0.01～50.0 mg·L-1、0.05～50.0 mg·L-1、0.01～20.0 mg·L-1和0.05～50.0 mg·L-1范围内呈线性相关，峰面积与浓度呈现良好的线性关系，药根碱、黄连碱、巴马亭和小檗碱的回归方程和相关系数依次为y=139718x-101208，R2=0.9993;y=53117x-4296,R2=0.9994;y=1598570x-933627,R2=0.9993和y=127291x-2514，R2=0.9999，检出限分别为1μg·L-1、6μg·L-1、0.2μg·L-1和0.1μg·L-1。加标回收率分别为98.6％、99.8％、98.5％、101.0％。结论:该法操作简便、选择性强、灵敏度高，可用于黄连药材及制剂中生物碱类化合物的质量控制。
　　 2.茶叶中生物碱的研究。目的:建立高效液相色谱-电喷雾离子-质谱联用技术同时检测可可碱、茶叶碱和咖啡碱三种活性成分的新方法。方法:实验采用Ultimate XB-C18色谱柱(150 mm×2.1 mm，3μm)，流动相:0.5％甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脱，流速:0.2 mL·min-1，柱温:35℃;质谱条件:电喷雾电离源(ESI);正离子扫描;多反应监测模式(MRM);喷雾针电压:4500 V;干燥气温度:350℃;干燥气压力:25 psi;碰撞气(Ar)压力:1.5 mT。结果:在最佳实验条件下，可可碱、茶叶碱和咖啡碱实现了基线分离。在正离子模式下根据化合物准分子离子峰和碎片离子峰，鉴定了化合物的结构。其中，准分子离子峰分别为m/z=180.9、180.9和194.9，定量离子峰分别为m/z=138、124和138，在最佳实验条件下，可可碱、茶叶碱和咖啡碱分别在0.05～50.0 mg·L-1、0.01～20.0 mg·L-1和0.005～20.0 mg·L-1范围内呈线性相关，峰面积与浓度呈现良好的线性关系，可可碱、茶叶碱和咖啡碱的回归方程和相关系数依次为y=154107x-90789，R2=0.9991;y=145178x-77282, R2=0.9989和y=112287x+693,R2=0.9996，检出限分别为2μg·L-1、7μg·L-1、和0.8μg·L-1，加标回收率分别为99.3％、99.9％和99.8％。结论:该法操作简便，选择性强、灵敏度高，可用于茶叶产品中生物碱类化合物的质量监控。
　　 3.苦参中生物碱的研究。目的:建立高效液相色谱-电喷雾离子-质谱联用技术同时检测苦参碱和氧化苦参碱两种活性成分的新方法。方法:实验采用Ultimate XB-C18色谱柱(150 mm×2.1 mm，3μm)，流动相:10mM乙酸铵水溶液(使用甲酸调整pH=3)-乙腈，等度洗脱，流速:0.2 mL·min-1，柱温:30℃;质谱条件:电喷雾电离源(ESI);正离子扫描;多反应监测模式（MRM）;喷雾针电压:4000 V;干燥气温度:300℃;干燥气压力:35 psi;碰撞气(Ar)压力:1.5 mT。结果:在最佳实验条件下，苦参碱和氧化苦参碱实现了基线分离。在正离子模式下根据化合物准分子离子峰和碎片离子峰，鉴定了化合物的结构。其中，准分子离子峰分别为m/z=249.1和265.1，定量离子峰分别为m/z=148和247，在最佳实验条件下，苦参碱和氧化苦参碱分别在0.005～20.0 mg·L-1和0.01～20.0 mg·L-1范围内呈线性相关，峰面积与浓度呈现良好的线性关系，苦参碱的回归方程和相关系数为y=260663x+33205，R2=0.9994，氧化苦参碱的回归方程和相关系数为y=1598570x+236468，R2=0.9990。苦参碱和氧化苦参碱的检出限分别为0.7μg·L-1和0.8μg·L-1。加标回收率分别为100.2％和99.7％。结论:该法操作简便，选择性强、灵敏度高，可用于苦参药材及制剂中生物碱类化合物的质量监控。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 引言

1．2 生物碱的一般性质

1．3 生物碱的分类

1．4 生物碱的提取方法

1．4．1 稀酸提取法

1．4．2 有机溶剂提取法

1．4．3 超声波提取法

1．4．4 氧化铝柱法

1．4．5 薄层层析法

1．4．6 MIXXOR提取器

1．4．7 微波提取法

1．4．8 超临界流体萃取法

1．5 生物碱的鉴定及检测现状

1．5．1 滴定法

1．5．2 化学降解反应

1．5．3 物性测定法

1．5．4 核磁共振谱(NMR)

1．5．5 氧化反应

1．5．6 紫外吸收光谱法(UV)

1．5．7 气相色谱法(GC)

1．5．8 红外光谱法(IR)

1．5．9 质谱法(MS)

1．5．10 高效液相色谱法(HPLC)

1．6 本课题的创新点

1．7 本课题研究的难点

第二章 黄连中四种生物碱成份的HPLC-MS／MS法测定

2．1 引言

2．2 实验

2．2．1 试剂和仪器

2．2．2 操作步骤

2．2．3 实验溶液的配制

2．2．4 样品预处理

2．2．5 色谱条件及条件的优化

2．2．6 质谱条件及条件的优化

2．3 结果和方法验证

2．3．1 黄连生物碱标准品和样品的总离子流图

2．3．2 黄连生物碱的一级、二级质谱图和裂解方式推测

2．3．3 线性范围和检出限

2．3．4 精密度

2．3．5 稳定性试验

2．3．6 加标回收率

2．3．7 样品分析

2．4 本章小结

第三章 茶叶中三种生物碱成份的HPLC-MS／MS法测定

3．1 引言

3．2 实验

3．2．1 试剂和仪器

3．2．2 操作步骤

3．2．3 实验溶液的配制

3．2．4 样品预处理

3．2．5 色谱条件及条件的优化

3．2．6 质谱条件及条件的优化

3．3 结果和方法验证

3．3．1 茶叶的生物碱标准品和样品的总离子流图

3．3．2 茶叶生物碱的一级、二级质谱图和裂解方式推测

3．3．3 线性范围和检出限

3．3．4 精密度

3．3．5 稳定性试验

3．3．6 加标回收率

3．3．7 样品分析

3．4 本章小结

第四章 苦参中两种生物碱成份的HPLC-MS／MS法测定

4．1 引言

4．2 实验

4．2．1 试剂和仪器

4．2．2 操作步骤

4．2．3 实验溶液的配制

4．2．4 样品预处理

4．2．5 色谱条件及条件的优化

4．2．6 质谱条件及条件的优化

4．3 结果和讨论

4．3．1 苦参生物碱标准品和样品的总离子流图

4．3．2 苦参生物碱的一级、二级质谱图和裂解方式推测

4．3．3 线性范围和检出限

4．3．4 精密度

4．3．5 稳定性试验

4．3．6 加标回收率

4．3．7 样品分析

4．4 本章小结

第五章 结论

参考文献

发表学术论文

致谢