可选择性捕获循环肿瘤细胞的三维聚合物软链的初步探索

摘要

恶性肿瘤是种严重的疾病，每年大约有820万人死于癌症。目前检测肿瘤的领域里的黄金标准是“活体组织检查”，而对循环肿瘤细胞(CTC)的检测，则可以作为“液体活检”部分替代传统方法，实现对癌症的无创、快速检测。然而CTC在血液里含量稀少，大约10亿个血细胞中只有1~100个，因此CTC的捕获和富集非常有挑战性。目前CTC的富集和检测领域已经涌现出很多方法，已有研究证明纳米结构有助于提高对CTC的检测效果，并且相比于无机纳米材料，柔性有机的纳米结构对CTC的捕获具有较好的效果。因此，基于前人经验，为进一步提高捕获效率，本课题制备了具有可捕获CTC潜力的三维聚合物软链平台。
　　为了实现高效率捕获CTC的三维软链平台的制备，本课题首先利用电化学手段将表面引发原子转移自由基聚合（ATRP）的引发剂和具有抗非特异性黏附能力的分子聚合沉积到导电介质表面，然后通过表面引发ATRP的方法制备出具有生物功能化及抗非特异性黏附能力的三维分子软链。通过这种方法得到的捕获平台，其本身具有良好的抗非特异性黏附能力，又可以通过控制分子链密度，分子链长和生物素功能化单体所占组分来调控最终的捕获能力，理论上具有可控的高效特异性捕获CTC的潜力。捕获平台的具体实现方法如下。
　　本课题通过溴代异丁酰溴与羟基化3，4-乙烯二氧噻吩（EDOT-OH）发生消去反应，合成具有表面引发ATRP能力的含溴乙烯二氧噻吩（EDOT）衍生物（EDOT-Br），并通过核磁共振波谱分析，确定了此表面ATRP引发剂的化学结构。
　　本课题通过两步法合成出了具有抗非特异性粘附能力的单体（含磷酸胆碱的EDOT衍生物）。第一步利用EDOT-OH与2-氯-2-氧-1,3,2-二氧磷杂环戊烷（COP）之间的消去反应生成EDOT-COP；第二步利用EDOT-COP与三甲胺的开环加成反应，最终获得EDOT-PC。通过核磁共振波谱对EDOT-PC进行分析，确定了此分子的化学结构，并证明了其具有极好的抗非特异性粘附能力。
　　本课题通过在乙腈中加入高氯酸锂作为掺杂离子，加入琥珀酸二辛酯磺酸钠（DSS）促进EDOT-PC的溶解性，最终将EDOT-Br和EDOT-PC稳定的共聚合沉积到导电基片上。并通过X射线光电子能谱分析(XPS)对共沉积膜的表征，证明本课题已经成功将EDOT-Br和EDOT-PC共聚到导电基片上，并且可以通过调整溶液中EDOT-Br的含量来控制导电基片上引发剂的密度。通过原子力显微镜的表征，通过循环伏安法电化学聚合可以获得表面粗糙度很低的聚合物膜。通过接触角表征，证明了通过调整聚合物中的EDOT-PC的含量可以对聚合物膜的亲水性进行良好控制。
　　本课题合成了两种生物素功能化的单体M-Biotin和Hema-Biotin，并在此基础上探索由导电高分子表面引发M-Biotin/Hema-Biotin与MPC的ATRP共聚合。为了获得稳定的表面引发ATRP共聚合方法，本课题尝试了三种不同的催化剂体系：一种为CuBr/联吡啶（bpy）；一种是CuBr2/bpy/抗坏血酸（VC）；一种是CuBr2/三(2-吡啶甲基)胺（TPMA）/VC。最终通过QCM表征分子链与链霉亲和素及模型蛋白的耦合效果，确定了CuBr2/TPMA/VC在本体系的表面引发ATRP聚合中具有最优效果。另外，此体系下生成的分子链同样具有极好的抗非特异性粘附能力，这种能力是进一步优化分子链捕获能力的前提。
　　为了最大化分子链上的抗体表达，本课题进一步优化了引发剂密度，生物素功能化共聚单体的组成和聚合时间（链长度）。通过QCM表征分子链与链霉亲和素的耦合能力，最终探索出了在引发剂密度为10％，生物素功能化共聚单体含量为5%，ATRP聚合时间6h的条件下，可以实现分子链对链霉亲和素和模型蛋白的最大化耦合，同时保持较低的链密度。通过接触角表征，发现随着聚合时间的增长，ATRP聚合生成的分子刷的亲水性会略有增强，超过6h以后会稳定在10°左右，证明了本体系具有良好的亲水性。

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1第一章 绪论

1.1循环肿瘤细胞(CTC)的初步认识

1.2捕获和检测CTC的研究进展

1.3课题的研究内容及意义

2第二章 表面ATRP引发剂和抗非特异性粘附分子的合成及电化学

2.1引言

2.2实验部分

2.3实验结果表征及讨论

2.4本章小结

3第三章 表面引发原子转移自由基聚合的初步探索

3.1引言

3.2实验部分

3.3试验结果表征及讨论

3.4本章小结

4第四章 三维聚合物软链耦合SA和Biotin-BSA能力的优化

4.1引言

4.2实验部分

4.3试验结果表征及讨论

4.4本章小结

5第五章 结论

参考文献

7攻读硕士学位期间的研究成果

致谢