BM-EPCs促进兔急性缺血后肢血管生成的实验研究

摘要

自从1997年Asahara报道了内皮祖细胞（EPCs）参与生后的血管发生、血管形成、构成血管内皮和形成新的血管以来，其对缺血心肌血管生成效应已被许多实验所证实。EPCs对缺血下肢的血管生成效应与之相似，但研究较少。近年来这种理论也受到了挑战，有人认为EPCs，尤其是由骨髓培养得到的EPCs（BM-EPCs）本身并不参与血管内皮的形成，而是通过自身的自分泌或旁分泌VEGF，HGF，G-CSF等细胞因子，趋化内皮细胞和平滑肌细胞形成新的血管。本实验设计采用自体移植来控制免疫反应对实验的影响，通过EPCs相对无限自我更新和克隆的特性扩增其数量，以期明确是否骨髓单核细胞诱导而来的EPCs直接参与血管生成，并明显促进兔缺血后肢新血管生成。为EPCs治疗下肢缺血更好地应用于临床积累依据。 目的： 由兔骨髓单核细胞诱导培养BM-EPCs，将其移植到切除股动脉的缺血后肢，通过对照观察明确1.是否BM-EPCs自身直接参与新生血管内皮的生成；2.BM-EPCs移植是否能在两周之内明显促进兔缺血后肢的血管生成。 方法和材料： 将24只新西兰白兔随机数字法分成实验组和对照组，在3%戊巴比妥钠全麻下（30-45mg/kg），结扎并切断左侧股总动脉近端及远端将分出胭动脉和隐动脉处，结扎并切断其间的包括股深动脉的所有可见分支。将此段血管游离丢弃，建成缺血模型。从右后肢胫骨上端以下1cm处穿刺髓腔抽取4ml骨髓，密度梯度离心法分离出单核细胞，EBM-2培养基添加VEGF、bFGF、IGF等因子诱导，贴壁筛选法选择培养BM-EPCs，与荧光偶联的AC-LDL、UEA-1结合，荧光显微镜鉴定。培养第10天，缺血模型建立后第7天计数并肌内移植到对应兔的缺血后肢，移植前一天将细胞与10umol/lBrdu共孵24h，将BM-EPCs标记，对照组注射相同体积的培养基。移植后7天分别随机从对照组和实验组用过量麻醉牺牲6只兔，取其内收肌标本，固定，分别用CD31、Brdu抗体标记毛细血管和BM-EPCs，计数毛细血管的数量，观察EPCs的位置；在14天同法牺牲余下的处理组6只兔和对照组的6只兔，同法免疫染色，计数毛细血管的数量，观察EPCs的位置。 结果： 1.通过直视下手术的方法，找到了约Ф1.2mm，Ф0.7mm的髂外动脉和股深动脉及可见的腹壁浅动脉、腹壁下动脉、侧旋支、胭动脉和隐动脉（见图1），进行了髂外分出处以远0.5cm到股动脉分出胭动脉和隐动脉处近端0.5cm处约2.5cm长的整段切除，完成了模型制作。术后所有动物立即出现了左后肢跛行，术后一周与健侧后肢相比均出现肌萎缩，1只出现皮肤干性溃疡。 图1家兔股部主要血管示意图引自第一部分参考文献[1] 2.选用密度为1.0965±0.001g／cm3的兔淋巴细胞分离液，对动物骨髓进行了密度梯度离心，离心后看到了白膜状分层标志，从兔股骨骨髓中分离到了单核细胞，用含有VEGF、bFGF、IGF和5%FBS的EGM-2培养基，结合贴壁筛选法，诱导出了针形的、可成集落的、呈线状网状生长的ac-LDL和UEA-1双结合试验阳性的BM-EPCs。 3.在实验组家兔后肢内收肌横切标本中的毛细血管内皮中观察到了Brdu标记的EPCs。细胞移植后7天，实验组和对照组标本每高倍视野的毛细血管数和毛细血管数/肌纤维比率分别为（x±sd n=6，下同）4.19±1.10和2.47±1.08，P=0.021；0.86±0.38和0.38±0.08，P=0.027。细胞移植后的14天实验组和对照组标本的以上两个指标分别为5.39±1.58和2.10±1.05，P=0.002；1.12±0.58和0.26±0.14，P=0.014。 结论： 1.本实验所培养的BM-EPCs直接参与了兔缺血后肢的血管生成； 2.BM-EPCs移植在两周之内明显促进了兔缺血后肢的血管生成。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

前言

实验设计和技术路线

第一部分 缺血模型的建立

目的

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 兔骨髓的采集、EPCs的培养、传代和鉴定

目的

材料和方法

3.结果

4.讨论

参考文献

第三部分 BM-EPCs在兔缺血后肢模型中的移植及观察

目 的

材料和方法

结果

讨论

附录

参考文献

结论

综述 内皮祖细胞的功能及应用研究进展

致谢

攻读硕士学位期间发表文章情况