半乳糖功能化磁性四氧化三铁纳米颗粒的合成及其在蓖麻毒素分析中的应用

摘要

蓖麻毒素是一种核糖体失活蛋白，由A、B两条链通过二硫键连接而成，其中B链具有半乳糖结合位点，可以介导毒素蛋白进入细胞；而A链是活性链，具有糖苷酶活性，通过水解核糖体RNA上的N-糖苷键使得腺嘌呤脱落导致核糖体失活，导致蛋白合成障碍，引起细胞死亡。由于蓖麻毒素具有极强的毒性、提取方法简便，极易被恐怖分子利用，因此已被列入《禁止化学武器公约》的第一类控制清单之中。为应对蓖麻毒素的潜在威胁，建立快速的分析检测方法具有十分重要的现实意义和军用价值。
　　 目前，对蓖麻毒素的分析检测方法主要集中在两个方向，一个是基于抗体的免疫学方法，另外一个就基于生物质谱的仪器分析方法。本课题从合成磁性Fe3O4纳米颗粒入手，建立了基于半乳糖功能化磁性Fe3O4纳米颗粒富集的免疫学分析检测方法，同时还建立了基于半乳糖功能化磁性Fe3O4纳米颗粒富集蓖麻毒素液相色谱三重四级杆质谱联用仪(LC-MS/MS)的仪器分析方法。基于上述内容，本论文分为三章：
　　 第一章简要介绍了蓖麻毒素的生化特性以及目前分析检测研究进展，并对磁性Fe3O4的合成、稳定性、功能化修饰以及在生物医学中的应用做了简单的概述。并在此基础提出了本论文的立题依据、研究意义和研究思路。
　　 第二章建立了基于半乳糖功能化磁性Fe3O4纳米颗粒检测缓冲液和血清样品中蓖麻毒素的分析方法。首先采用化学共沉淀法合成磁性Fe3O4纳米颗粒，通过包被硅烷化试剂得到氨基化的磁性纳米颗粒，再将化学修饰的半乳糖共价连接到磁性纳米颗粒的表面，并对合成的磁性纳米颗粒进行了表征。测定结果表明所得到的磁性纳米颗粒的半乳糖载量约为30μg/mg，蓖麻毒素的结合量约为29μg/mg。将获得的磁性Fe3O4纳米颗粒用于蓖麻毒素的检测分析，结果显示生理缓冲液样品中的毒素在2-64 ng/mL范围内线性良好，检测限为2 ng/mL，而血清样品中添加的毒素在4-64 ng/mL范围内线性良好，检测限为4 ng/mL。该方法检测时间短(3小时)，血清样品干扰小，可用于快速分析检测样品中所含的蓖麻毒素。
　　 第三章建立了基于LC-MS/MS检测蓖麻毒素的方法。首先基于前期工作选取了蓖麻毒素胰酶酶解所产生的特异性肽段，并对其进行了筛选，选择出用于定性、定量的肽段，对选取的肽段进行了质谱参数优化；再在半乳糖功能化磁性Fe3O4纳米颗粒的富集浓缩的基础上将所建立的液相色谱质谱联用技术用于蓖麻毒素的定量分析，该方法在毒素浓度为5 ng/mL-1μg/mL范围内呈现良好线性关系，最低检测限可达到2 ng/mL，这与普通酶链免疫分析的灵敏度相当。由于该方法特异性较好，可以与免疫学方法相互补充，提高检测的准确性，同时也为蓖麻毒素的溯源性检测提供了可能。