环氧合酶2与肺癌的关系及其选择性抑制剂对肺癌作用的实验研究

摘要

肺癌是当今世界上严重威胁人类健康与生命的恶性肿瘤，发病率在许多国家呈明显增高趋向。近年来在我国许多大城市，肺癌已在恶性肿瘤的发病率中占据第一位。虽然近年来对肺癌的发病机制研究有了很大的进展，但肺癌的长期存活率仍非常低。2002年报告我国肺癌的5年生存率仅8％。在癌症死亡中肺癌已是男性的第一死亡原因，女性的第三死亡原因。为此，积极寻找新的肺癌治疗和预防方法是目前研究的热点之一。 近年来，流行病学调查以及对结肠癌动物模型的研究发现非甾体类抗炎药物(NSAIDs)具有抗结肠癌活性作用。长期服用阿司匹林或其它NSAIDs类药物病人与未用药者相比患结肠癌的危险性下降40％至50％。许多动物实验也证明NSAIDs有抑制结肠肿瘤发生、发展的作用。环氧合酶(cyclooxygenase，COX)催化花生四烯酸(AA)转化为前列腺素(PGs)，然后通过其过氧化酶活性催化PGs转化为具有活性的终产物PGEs、PGFs、PGI2和TXA2等，参与维持机体的各种生理和病理功能。1991年证实有两种COX存在，包括COX-1和COX-2，传统的NSAIDs为非选择性COX抑制剂，同时抑制COX-1和COX-2活性。许多研究表明COX-2在多种人类肿瘤中表达增加，包括结肠癌、肺癌、乳腺癌、胃癌和胰腺癌等。这些发现提示COX-2在这类肿瘤的发生发展中可能起着一定作用。 消化道肿瘤的动物实验研究报告表明，COX-2选择性抑制剂能降低实验动物肿瘤的发生、发展，其药理机理可能与诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞增殖有关。塞来昔布(celecoxib)是高度选择性COX-2抑制剂；从绵羊精囊微粒体和胎盘中分别分离出COX-1和COX-2，用塞来昔布体外抑制的实验表明塞来昔布只选择性抑制COX-2，而对COX-1无明显抑制作用。报道认为，塞来昔布可选择性抑制小鼠COX-2活性，降低COX-2高水平表达的结肠癌细胞的血道转移。与结肠癌相比，肺癌中尤其是肺腺癌具有结肠癌某些病理生理特征；因此有研究者推测，肺腺癌与结肠癌可能具有某些共同的发生机制。 该课题观察了COX-2选择性抑制剂塞来昔布对肺癌的抑制作用，探讨塞来昔布在体内和体外对肺癌细胞生长、细胞凋亡和转移的影响。同时，对塞来昔布诱导肺癌细胞凋亡、抑制肿瘤细胞生长的作用机理进行探讨，以了解选择性COX-2抑制剂在人类肺部肿瘤的治疗作用。 研究方法 1.体外细胞培养Lewis肺癌细胞，应用MTT比色法检测选择性COX-2抑制剂塞来昔布对Lewis肺癌细胞增殖的影响；采用流式细胞仪技术检测药物对Lewis肺癌细胞凋亡和细胞周期的影响。 2.将20只C57BL/6小鼠随机分为实验组和对照组，于皮下接种Lewis肺癌细胞，第二天开始实验组用含1000ppm塞来昔布的食物饲养，连续24天后两组均取出移植瘤，用电子天平称重，计算抑瘤率。取出小鼠肺脏，用解剖显微镜观察并记录两组小鼠肺转移灶数目和大小。 3.酶联免疫吸附分析法(ELISA法)检测体外Lewis肺癌细胞与3.1-120umol/L塞来昔布培养72小时后上清液的VEGF和MMP-2浓度；酶联免疫吸附分析法(ELISA法)检测两组C57BL/6小鼠血清MMP-2浓度。 4.免疫组化法分别测定两组小鼠移植瘤组织以及临床肺癌患者手术切除的非小细胞肺癌标本中的COX-2、VEGF、MMP-2、TIMP-2蛋白和MVD。 5.透射电镜观察两组小鼠移植瘤组织Lewis肺癌细胞超微结构的变化。 6.半定量RT-PCR法检测两组小鼠移植瘤组织VEGF、MMP-2和TIMP-2mRNA表达水平。 结果 1.COX-2选择性抑制剂塞来昔布对体外培养的Lewis肺癌细胞增殖有抑制作用，效应呈剂量和时间依赖性。塞来昔布还可诱导肿瘤细胞凋亡，与对照组比较，凋亡率分别为14.93±0.79％和4.73±0.83％，差异有统计学意义(P＜0.001)。 2.给C57BL/6小鼠喂养含1000ppm塞来昔布的食物，实验组与对照组比较明显抑制Lewis肺癌移植瘤生长，24天后小鼠移植瘤重量分别为1.37±1.04和3.49±1.75克，差异有统计学意义(P＜0.01)，抑瘤率为60.1％。实验组和对照组小鼠的肿瘤肺部转移率分别为50％(5/10)和40％(4/10)，差异无统计学意义(P＞0.05)。 3.Lewis肺癌细胞培养上清液的VEGF蛋白浓度随塞来昔布剂量的递增而下降，120umol/L塞来昔布时VEGF最低浓度为41.01±9.05ng/L，与对照组362.23±36.00ng/L相比差异有统计学意义(P＜0.01=。细胞培养上清液及C57BL/6小鼠血清MMP-2蛋白浓度，实验组与对照组差异无统计学意义(P＞0.05)。 4.透射电镜观察Lewis肺癌组织，实验组移植瘤组织出现较多有凋亡特征的细胞，可见凋亡小体。对照组肿瘤细胞很少出现凋亡特征的细胞。 5.免疫组化结果显示COX-2与VEGF积分有明显的相关性(r=0.696，P＜0.01)。实验组VEGF积分降低，为2.00±0.82，与对照组2.90±0.88比较差异有统计学意义(P＜0.05)。实验组MVD平均值减低为16.70±7.77，对照组为23.15±4.58，差异有统计学意义(P＜0.05)。 实验组肿瘤组织的COX-2积分为3.14±0.92，低于对照组3.89±0.85，但差异无统计学意义(P＞0.05)。免疫组化MMP-2和TIMP-2积分，实验组与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。 6.半定量RT-PCR方法检测实验组VEGFmRNA表达较对照组明显下调(0.609±0.109vs1.067±0.071)，差异有统计学意义(P＜0.01)。而MMP-2mRNA和TIMP-2mRNA表达改变无统计学意义。 7.人非小细胞癌标本中COX-2表达阳性率为66.7％，并与肿瘤大小、淋巴结转移、组织类型和临床TNM分期相关，VEGF、MMP-2和TIMP-2表达阳性率分别为68.8％、47.9％和41.7％。COX-2、VEGF、MMP-2的表达在有淋巴结转移组阳性表达率(分别为85.0％、85.0％、65.0％)均显著高于无淋巴结转移组(分别为53.6％、57.1％、35.7％)，差异有统计学意义(P均＜0.05)。 结论 1.选择性COX-2抑制剂塞来昔布可在体外抑制Lewis肺癌细胞增殖，作用机制可能该药诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞增殖。 2.塞来昔布对小鼠Lewis肺癌移植瘤有明显抑制作用。可能通过抑制Lewis肺癌细胞COX-2的活性，并进而抑制VEGF的表达，减少新生血管形成，从而抑制Lewis肺癌的生长。抑制肿瘤血管生长可能是塞来昔布抑制肺癌发展的机制之一。但塞来昔布在体内和体外均不能抑制Lewis肺癌细胞MMP-2的表达。 3.人非小细胞肺癌中存在COX-2的高表达，COX-2通过增加VEGF表达而促进肿瘤部位的血管生成，COX-2在非小细胞肺癌的发生、发展中起着重要作用。非小细胞肺癌中COX-2的高度表达与其发生、发展及淋巴结转移有关，提示抑制COX-2活性是抑制NSCLC生长和转移的途径之一。

目录

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主要英文缩写

前言

第一部分 塞来昔布对Lewis肺癌细胞抑制作用的实验研究

材料

方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 塞来昔布对Lewis肺癌组织COX-2、VEGF、MVD表达的影响

材料

方法

结果

讨论

结论

参考文献

第三部分 塞来昔布对Lewis肺癌MMP-2表达及移植瘤肺部转移的影响

材料

方法

结果

讨论

结论

参考文献

第四部分 COX-2、VEGF、MMP-2在人非小细胞肺癌中的表达及其与MVD相关性的研究

材料

方法

结果

讨论

结论

参考文献

总结

综述 环氧合酶2与肺部肿瘤

附图1

附图2

附图3

附图4

附图5

附录 博士在读期间发表论文

致谢