骨髓来源内皮前体细胞与肿瘤新生血管的关系

摘要

肿瘤新生血管(Angiogenesis)与肿瘤生长、转移密切相关。新生血管不仅提供肿瘤代谢所需的氧气、营养物质，带走代谢产物，维护肿瘤局部微环境稳定，而且为肿瘤的血行转移提供了途径。肿瘤新生血管形成有多种途径，但具体形成机制目前正在进一步深入研究中。一般认为在肿瘤快速生长期，肿瘤组织内部及周围因缺氧等因素，内皮细胞激活后增殖，在原有血管外围形成内皮细胞簇，随着基质金属蛋白酶(MMPs)等激活，在血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(B-FGF)等诱导下，内皮细胞排列成管腔样结构，并形成基底膜，以类似出芽的方式生成肿瘤新生血管；另外，某些肿瘤细胞可以直接排列成为管道状结构，通过血管拟态，在肿瘤内部形成类似血管的血流通道，提供氧气和营养物质。目前对肿瘤新生血管生成的机理研究正在进一步深入，通过进一步了解肿瘤新生血管形成机理，并应用抑制肿瘤新生血管形成的方法抑制肿瘤细胞增殖、转移，对于了解肿瘤病理性血管形成机理及抗血管形成治疗具有重要的意义。 干细胞是指具有自身增殖能力，有多种潜在分化能力的原始细胞，在不同诱导条件下可以分化为不同类型的细胞。除胚胎组织富含干细胞外，出生后骨髓是干细胞的主要富集场所，具有多种不同分化潜能的干细胞。随着对骨髓来源干细胞研究深入，发现骨髓内有一类细胞，具有定向分化为成熟内皮细胞或血细胞的潜能，这些细胞被称为骨髓来源的内皮前体细胞(EndothelialProgenitorCells，EPCs)。EPCs具有重要的生理、病理作用。起源于小鼠胚胎期卵黄囊血岛中EPCs参与小鼠主动脉弓发育、形成；出生后EPCs在女性月经周期的子宫内膜的生长、1皮肤伤口愈合、缺血性组织损伤、糖尿病性视网膜炎、急性心肌梗塞恢复期新生血管形成等过程中均起重要作用。近来研究提示骨髓中某些细胞在肿瘤新生血管形成过程中，可以在肿瘤局部定位，进一步成熟、分化为功能性的内皮细胞。深入研究发现这些细胞表达CD31、CD133、KDR等EPCs特异性标志，提示骨髓来源EPCs可能在肿瘤新生血管形成中起到一定作用，但也有研究提示未发现EPCs参与肿瘤新生血管形成。 该研究首次建立了研究骨髓来源EPCs与肿瘤新生血管内皮形成关系的实验动物模型，为进一步研究EPCs形成新生血管的机理提供了研究工具。研究中通过将正常C57BL小鼠骨髓灭活后，移植GFP转基因C57BL荧光小鼠的骨髓，使受体小鼠骨髓来源的细胞均表达GFP，通过荧光显微镜可以观察骨髓细胞在肿瘤局部定位情况。GFP荧光小鼠骨髓植入成活后，受体C57BL小鼠皮下接种C57BL小鼠来源的低分化肺腺癌细胞Lewis系细胞。观察小鼠移植肿瘤生长情况，通过观察肿瘤局部组织GFP荧光表达情况，检测新生血管局部骨髓来源细胞定位，首先明确在肿瘤新生血管局部是否存在骨髓来源的某些细胞；观察到骨髓来源细胞在肿瘤新生血管定位后，进一步检测肿瘤新生血管定位的骨髓细胞性质，通过间接免疫荧光法及免疫组化法检测肿瘤局部新生血管内皮CD31、CD34、CD133、VE-Cadherin、KDR等EPCs标志表达，明确参与肿瘤新生血管内皮形成的骨髓来源细胞是否为EPCs；通过流式细胞仪(FCM)检测肿瘤组织内同时表达骨髓GFP(绿色荧光)以及CD31、CD133(间接免疫荧光标记红色荧光)阳性的荧光细胞，了解EPCs分化来源与通过肿瘤周围血管内皮出芽形成在肿瘤新生血管内皮的大致比例；为明确VEGF、细胞间粘附分子(ICAM)与EPCs在肿瘤局部新生血管的作用，ELISA法检测血清VEGF、ICAM水平，研究VEGF、ICAM与内皮前体细胞在肿瘤新生血管定位的相关性；为观察Endostatin、SU-5416(VEGFR-2特异性酪氨酸蛋白激酶抑制剂)等肿瘤新生血管抑制剂对内皮前体细胞在肿瘤局部定位的影响，通过尾静脉注射药物后观察肿瘤生长及EPCs在肿瘤组织局部定位、增殖情况；用WesternBlot检测肿瘤组织VE-Cadherin，KDR蛋白表达水平，检测上述药物对肿瘤新生血管的内皮特异性标志表达的影响。 通过该研究，首先成功建立了骨髓移植小鼠的肿瘤移植模型，为下一步研究EPCs与肿瘤新生血管的关系奠定了基础。骨髓完全灭活的小鼠接受GFP转基因荧光小鼠骨髓后，2周内骨髓植活，在小鼠骨髓中可以观察到骨髓细胞均表达供体来源的GFP荧光。荧光显微镜观察到肿瘤新生血管局部有表达GFP的骨髓来源细胞，通过免疫组化实验证实部分骨髓来源的细胞为CD31、CD34、CD133、阳性的EPCs；间接免疫荧光实验也观察到肿瘤新生血管局部有同时表达GFP的绿色荧光以及CD133、CD31、KDR的红色荧光，证明这些骨髓来源细胞具有EPCs特异性的细胞表面标志；FCM检测GFP荧光的骨髓细胞以及TRITIC标记的CD31、CD133阳性细胞，结果发现在该研究模型中，肿瘤组织内血管内皮细胞部分通过出芽等方式来源于原有血管的内皮细胞，还有约35％来源于骨髓来源的内皮前体细胞，肿瘤新生血管过程中，有多种血管形成机制参与；通过EIA法，检测小鼠肿瘤快速生长期血清VEGF、ICAM水平，结果提示在肿瘤快速生长期，VEGF、ICAM均明显升高，与骨髓来源EPCs的动员、在肿瘤新生血管局部定位相关；VEGF、B-FGF促进骨髓来源EPCs在肿瘤新生血管定位，并进一步分化成熟为功能性内皮细胞；而肿瘤新生血管抑制因子Endostatin、SU-5416抑制骨髓内皮细胞在肿瘤新生血管定位，抑制肿瘤新生血管的形成，肿瘤生长明显减慢；通过WesternBlot检测肿瘤局部VE-Cadherin、KDR表达水平，提示B-FGF、VEGF均促进VE-Cadherin、KDR表达，与Endostatin、SU-5416可抑制VE-Cadherin、KDR表达。 通过该研究，首先建立了EPCs参与形成肿瘤新生血管的实验动物模型，有助于以后类似研究开展。传统观念的肿瘤新生血管形成一般使在原有肿瘤周围血管在缺氧等条件下，肿瘤组织分泌VEGF、B-FGF等促血管生长因子，原有血管内皮细胞激活，并进一步增殖，迁移到肿瘤组织，形成肿瘤新生血管的内皮细胞。该研究在前人研究基础上，进一步证明骨髓来源的细胞参与了肿瘤新生血管形成，骨髓来源EPCs与肿瘤生长及新生血管形成密切相关，肿瘤局部新生血管内皮部分来源于骨髓EPCs，证实了肿瘤新生血管形成的一种新的机理；影响EPCs形成肿瘤新生血管内皮过程中，VEGF与B-FGF促进EPCs在肿瘤局部定位，增殖，并进一步分化为功能型内皮细胞，在血管形成的病理过程中起了重要作用；而SU-5416、Endostatin均可抑制EPCs参与的肿瘤新生血管形成。SU-5416是一种抑制内皮VEGFR-2酪氨酸蛋白激酶(TPK)的喹啉类小分子化合物，特异性阻断VEGFR2特异性的TPK活性，SU5416抑制EPCs参与形成肿瘤新生血管形成，提示在EPCs激活过程中，VEGFR2激活后的酪氨酸磷酸化等后续步骤在EPCS激活的细胞内信号转导过程中起到重要作用；Endostatin抑制EPC形成新生血管的具体机理目前还存在争论，一般认为其可诱导EPCs凋亡，阻断EPCs分化成熟过程。 该研究通过对EPCs参与肿瘤新生血管形成的研究，丰富了肿瘤新生血管形成的机理，证实EPCs在肿瘤新生血管局部定位、增殖、分化，进一步分化为功能型内皮细胞。通过不同途径抑制骨髓源性的EPCs参与肿瘤新生血管形成，可有效抑制肿瘤生长、转移，为针对肿瘤新生血管形成的治疗提供了新的尝试。

目录

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中英文摘要

中文详细摘要

英文详细摘要

英文缩写、代码对照词表

技术路线示意图

前言

第一部分：骨髓来源内皮前体细胞与肿瘤新生血管形成的荷瘤小鼠模型的建立

1.材料和方法

实验结果

3.讨论

第二部分：骨髓来源内皮前体细胞与肿瘤新生血管的关系

第三部分：VEGF、B-FGF、Endostatin、SU5416对骨髓来源内皮前体细胞参与形成肿瘤新生血管内皮的关系

材料和方法

实验结果

讨论

第四部分：VEGF、ICAM与内皮前体细胞形成血管内皮细胞的关系

材料和方法

结果

讨论：

第五部分：VE-Cadherin、KDR表达与内皮前体细胞参与生成肿瘤新生血管的关系

材料和方法

实验结果

讨论

小结

参考文献

综述 内皮前体细胞与肿瘤新生血管的关系

致谢

附录