诱导型环氧合酶及CD40配体对动脉粥样硬化斑块稳定性影响的实验研究

摘要

目的 Rose认为动脉粥样硬化(AS)是一种炎症性疾病，炎症反应贯穿于AS病变的发生、发展及斑块稳定性的各个阶段并扮演了十分重要的角色。诱导型环氧合酶(COX-2)及CD40与其配体(CD40L)均在炎症性疾病中起着重要作用。二者相互作用不只局限于炎症细胞之间信号传递，还参与AS内主要细胞成分(包括血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、巨噬细胞等)的炎症反应调节，并通过调节一系列细胞因子和细胞内信号通路影响AS的发生、发展及斑块的稳定性，有可能成为防治AS或急性冠脉综合征(ACS)潜在的新靶点。胶原含量和基质金属蛋白酶水平是评价斑块易损性的重要指标。虽然初步研究发现CD40-CD40L可以诱导AS细胞中COX-2的表达，但CD40-CD40L引发的一系列致AS反应是否与诱导COX-2表达有关尚不明确，而且二者之间的信号传导机制还不很清楚，该课题就此进行了研究。首先，以AS斑块中胶原含量和基质金属蛋白酶(MMPs)水平作为评价斑块易损性的指标，探讨COX-2与AS斑块稳定性之间的关系及COX-2抑制剂对其的作用。其次，离体水平观察COX-2和rhCD40L对细胞表达MMPs和人Ⅰ型胶原α2(Ⅰ)链基因启动子的影响。最后从基因、蛋白、酶活性三个水平观察rhCD40L对细胞表达COX-2的影响，并探讨丝裂酶原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路与rhCD40L诱导COX-2的关系。总之，通过以上几个部分的研究，以胶原和MMPs为观察指标，探讨COX-2与CD40L对AS斑块稳定性的影响，二者在此过程中的关系及其信号传导机制，进而探讨COX-2抑制剂潜在的抗AS作用。 方法 1、高脂饮食法建立兔动脉粥样硬化模型，分为正常组、AS组、阿司匹林治疗组、莫比可治疗组、阿司匹林+莫比可治疗组和他汀治疗组，取主动脉标本行HE染色，并分别进行COX-1、COX-2、MMP-2、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原免疫组化染色，观察不同类型COX抑制剂对AS斑块中胶原和MMP-2表达的影响。 2、U937细胞经rhCD40L刺激后，明胶—聚丙烯酰铵凝胶电泳法观察阿司匹林(100μM)和选择性COX-2抑制剂NS-398(100μM)对rhCD40L诱导的U937细胞表达MMP-2和MMP-9的影响。 3、人Ⅰ型胶原α2(Ⅰ)链基因启动子重组质粒pCOLH22.4和pCOLH21.6扩增和酶切鉴定后，通过脂质体(Lipofectamin)转染人血管平滑肌细胞(VSMCs)，rhCD40L刺激转染后细胞，ELISA检测CAT目的基因表达以及阿司匹林(100μM)和NS-398(100μM)的影响。 4、U937细胞经rhCD40L不同浓度(0.05、0.1、0.2、0.4μg/ml)和时间(3、6、12、24小时)刺激后，RT-PCR、Western-blot检测rhCD40L诱导COX-2mRNA和蛋白表达的时效性和量效性，ELISA检测U937细胞合成的PGE2代表COX-2酶活性；RT-PCR、Western-blot检测阿司匹林(100μM)和NS-398(100μM)及普伐他汀(10-2M、10-3M、10-4M)对COX-2mRNA和蛋白表达的影响；以PD98059(p42/44MAPK抑制剂)和SB203580(p38MAPK抑制剂)以及磷酸化.JNK抗体、检测rhCD40L诱导COX-2的细胞内信号转导通路。 结果 1.COX-2主要在兔AS斑块处表达，正常主动脉未见COX-2表达，COX-1在正常动脉壁及AS斑块处均有表达；与正常动脉壁比较，AS斑块中MMP-2表达增加，Ⅰ/Ⅲ型胶原比例增加；与AS组比较，阿司匹林组、莫比可组、阿司匹林+莫比可组和他汀治疗组AS斑块中COX-1、COX-2及MMP-2表达减少，Ⅰ/Ⅲ胶原比例下降；他汀治疗组各项指标均优于其他3个治疗组，在其他治疗组中无明显变化。提示COX-2与斑块易损性有密切关系，抑制COX-2表达有可能改善斑块稳定性。 2.rhCD40L刺激U937细胞可诱导MMP-2和MMP-9表达；阿司匹林和NS-398对MMP-2和MMP-9表达均有明显的抑制作用(p＜0.05)，二者间无显著性差异；NS-398对rhCD40L诱导的MMP-2和MMP-9表达的抑制作用更明显(p＜0.05)。 3.人Ⅰ型胶原α2(Ⅰ)链基因启动子重组质粒pCOLH22.4和pCOLH21.6扩增和酶切鉴定后，通过脂质体(Lipofectamin)转染入血管平滑肌细胞(VSMCs)，rhCD40L刺激转染后细胞，ELISA检测发现CAT目的基因表达下降；阿司匹林和NS-398均可以增加CAT目的基因表达，并逆转rhCD40L诱导的CAT目的基因表达下降，NS-398的作用强于阿司匹林(p＜0.05)。 4、rhCD40L可诱导COX-2的基因和蛋白表达、并刺激细胞合成PGE2、均表现出时效和量效关系(p＜0.01)；阿司匹林和NS-398对COX-2蛋白表达无明显影响(p＞0.05)；普伐他汀可明显抑制rhCD40L引起的COX-2mRNA和蛋白表达；PD98059(25μM)、SB203580(20μM)、以及二者共同作用均使rhCD40L诱导的COX-2蛋白表达明显减少(p＜0.01)；rhCD40L刺激后引起活化的JNK蛋白表达，其时间窗口为15-120分钟。 结论 1、COX-2而非COX-1在AS斑块中被诱导表达同时伴有胶原和MMPs含量变化，提示COX-2与斑块易损性有密切关系，抑制COX-2表达有可能改善斑块稳定性。 2、CD40L和COX-2均可影响胶原和MMPs的表达，CD40L对胶原和MMPs的作用部分通过上调COX-2实现，CD40L通过激活细胞内MAPK信号通路诱导COX-2表达。 3、COX-2参与了AS病理发生以及斑块易损化中的炎症反应过程，有望成为抗AS、特别是稳定斑块治疗的新靶点。选择性COX-2抑制剂能够降低AS炎症反应、可能对防治AS和急性冠脉事件具有潜在的应用价值。

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缩写词表

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英文详细摘要

前言

第一部分环氧合酶抑制剂对兔主动脉粥样硬化组织中胶原和MMP-2表达的影响

材料和方法

结果

讨论

第二部分COX-2及CD40配体对基质金属蛋白酶的影响

材料和方法

结果

讨论

第三部分rhCD40L及COX抑制剂对人I型胶原α2(I)链启动子活性的调控

材料和方法

结果

讨论

第四部分重组人CD40配体对诱导型环氧合酶的作用及其信号通路的探讨

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

致谢

文献综述诱导型环氧合酶-2(COX-2)与动脉样硬化斑块稳定性