CK-794致小鼠毛发生长发育异常动物模型的建立及其基因表达谱的分析

摘要

一、CK-794致ICR小鼠毛发生长发育异常动物模型的建立 1.给药剂量的选择及毛发性状观察 1.1给药剂量的选择试验分6个组，即：5.0mg/kg、7.5mg/kg、10.0mg/kg、15.0mg/kg、20.0mg/kg及溶剂对照组。于GD12～PD21时分别给予孕鼠不同剂量的CK-794和溶剂，观察仔鼠的毛发性状，包括毛发的密度、直径、长度以及形态，以及仔鼠臀部无毛(在PD8～PD12时，以臀部未见毛发计)发生率。 1.2毛发性状观察在PD4时，肉眼观察各剂量组与对照组仔鼠无明显差异。在PD8时，对照组仔鼠长出的白色毛发已覆盖全身；5.0mg/kg组的仔鼠能见到少量毛发；而7.5mg/kg组的仔鼠只在颈部有少量绒毛；10.0mg/kg组的仔鼠，肉眼未见毛发。在显微镜下，对照组及5.0mg/kg的仔鼠可以根据毛发的直径分为粗细两大类，而7.5mg/kg、10.0mg/kg则只有一种弯曲的细毛发，而且背部有较多皮屑。 2.毛发生长发育异常是否具有遗传性的观察选取10.0mg/kg组仔鼠喂养至成年后合笼，观察其后代小鼠的毛发。与同期对照组仔鼠比较未发现明显异常。表明该毛发生长异常表型无遗传性。 3.不同时段接触药物对毛发生长发育的影响用对照及10.0mg/kg组进行交叉哺育实验，结果发现在PD8时，孕期组也长出较多毛发，但毛发长度较对照组短；哺乳期组在颈部有较多排列紊乱的绒毛，在臀部也可见少量绒毛；哺乳期+孕期组只在颈部有少量绒毛，臀部无毛。 PD12时，孕期组在毛发的类型、密度方面与对照组无明显差异，只是毛发的长度较对照组短；哺乳期小鼠体型瘦小，颈部有较多毛发，但排列紊乱，臀部有稀疏的细绒毛；孕期+哺乳期组仍只在颈部有少量绒毛，臀部无毛。 可见CK-794在孕期及哺乳期对仔鼠的毛发都有影响，而在哺乳期的作用更为明显。 二、Ck-794致C57BL/6小鼠毛发生长发育异常动物模型的建立1.给药剂量和毛发性状观察1.1给药剂量选择三个剂量组即5.0mg/kg、7.5mg/kg、10.0mg/kg组及一个对照组进行实验。 1.2CK-794引起的毛发异常毛发性状的观察在PD4时，各组仔鼠无明显差异。在PD8时，7.5mg/kg及10.0mg/kg组的仔鼠背部有很多皮屑，肉眼未见毛发。在显微镜下观察到对照及5.0mg/kg组的仔鼠毛发按直径可分为粗细两类，而7.5mg/kg及10.0mg/kg只有一种很细的弯曲毛发。 PD12时，7.5mg/kg及10.0mg/kg组仔鼠体型较对照组和5.0mg/kg组仔鼠略小。对照组毛发齐整；5.0mg/kg组也长出较多毛发；7.5mg/kg组在颈部有较多绒毛，臀部仍有较多皮屑，可见少量绒毛；10.0mg/kg组在颈部有少量绒毛，臀部无毛，全身有皮屑。对照组毛发可以分辨出awl及guard，此期开始出现zigzag，多数只有一个转折点；5.0mg/kg组也可以分辨出awl及guard，只是长度明显小于对照组；7.5mg/kg组无法分类；毛发在根部直，有较多毛发在毛尖部有弯曲；10.0mg/kg组毛发多弯曲，直径和长度都小于7.5mg/kg组。 PD16时，7.5mg/kg及10.0mg/kg组仔鼠体型仍较小。5.0mg/kg毛发与对照相比略显蓬松；7.5mg/kg全身已有较多毛发，臀部有少量皮屑；10.0mg/kg组臀部无毛，全身有大量皮屑。对照组zigzag的转折点增至2个；5.0mg/kg组也开始出现zigzag，但只有一个折点；7.5mg/kg组也有两类毛发，出现zigzag，直径明显比对照及5.0mg/kg组的zigzag要小；10.0mg/kg大部分毛发仍弯曲。 PD20时，7.5mg/kg及10.0mg/kg组仔鼠体型仍较小。5.0mg/kg组毛发与对照组无差异；7.5mg/kg虽然已长出较多毛发，但较蓬松；10.0mg/kg在颈部也长出较多毛发，臀部也有绒毛，仍有大量皮屑。5.0mg/kg组已有对照组中出现的各种毛发，zigzag也有三个折点；7.5mg/kg组的zigzag仍只有一个折点；10.0mg/kg组大部分毛发仍然弯曲。 CK-794对毛发生长周期也有影响，PD20时，对照及5.0mg/kg组已进入catagen或telogen；但7.5mg/kg及10.0mg/kg组的毛发仍处于anagen。PD30时，对照及5.0mg/kg组已进入anagen；但7.5mg/kg及10.0mg/kg组的毛发仍处于catagen或telogen。 C57BL/6小鼠在相同的时间段以相同的途径给予同样的剂量后，小鼠毛发异常的表型与ICR小鼠相似。 2.不同时段接触药物对毛发生长发育的影响PD8时，孕期组的仔鼠的毛发与对照组相似，但毛发长度比对照组短；哺乳期组及孕期+哺乳期组背部无毛，都有较多皮屑，镜下可见一种较细的毛发。 PD12时，对照组及孕期组都有整齐而浓密的毛发。哺乳期及孕期+哺乳期组全身无毛，有较多的皮屑，体型明显小于对照组。 可见CK-794在孕期及哺乳期对仔鼠的毛发都有影响，而在哺乳期的作用更为明显。 三、CK-794致小鼠毛发生长发育异常仔鼠皮肤毛囊组织基因表达谱分析用Affymetrix公司小鼠全基因组表达芯片对实验(10.0mg/kg)组及对照组PD8时的仔鼠背部皮肤毛囊组织中的基因表达情况进行了分析。结果显示表达显著下调(SLR≦-2)的基因有221个，表达显著上调(SLR≧2)的基因有240个。 在芯片中列出的17种Ⅰ型角质蛋白基因(Krt1)中检测到有15种在对照组皮肤毛囊组织中有表达，而在实验组皮肤毛囊组织中只能检测到有13种有表达；在对照组皮肤毛囊组织中有表达的15种Krt1中，有10种在给药组仔鼠的皮肤毛囊组织中的表达明显下调，另有3种的表达未发生明显变化，有2种的表达上调。在芯片中列出的15种Ⅱ型角质蛋白基因(Krt2)中检测到有12种在对照组皮肤毛囊组织中有表达，而在实验组皮肤毛囊组织中只能检测到有8种有表达；在对照组皮肤毛囊组织中有表达的12种Krt2中，有9种在给药组仔鼠皮肤毛囊组织中的表达明显下调，另有2种的表达未见明显变化，有1种升高。在芯片中列出的28种角质蛋白相关蛋白基因(Krtap)中检测到有27种在对照组皮肤毛囊组织中有表达，而在实验组皮肤毛囊组织中只能检测到有16种有表达；在对照组皮肤毛囊组织中有表达的27种Krtap中的绝大部分(25种)在给药组仔鼠的皮肤毛囊组织中的表达明显下调，还有1种的表达稍微下调，另有1种的表达未发生明显变化。由此可见CK-794抑制了大多数Krt1、Krt2及Krtap的表达，使得构成毛发主要成分的蛋白质的合成减少，这可能直接导致了给药组仔鼠毛发在直径、长度及形态方面与对照组仔鼠毛发的明显差异。 这次实验发现，许多在以前的研究中证实与毛发生长发育关系密切的一些基因的表达发生明显的变化。其中，Hoxc13的表达下调4.3倍，Lefl的表达下调4.6倍，Foxn1的表达下调8.0倍，Msx2的表达下调9.2倍。而这些基因都能直接或间接诱导Krt或Krtap的表达。而能抑制Lefl对Krt的诱导作用的Dkkl1的表达上调4倍。从以上的结果可以看出，给予CK-794后，参与调控Krt及Krtap表达的一些基因也发生了变化，这可能也是导致大部分Krt及Krtap表达下调的原因。同时还发现一些以前很少报道与毛发生长发育有关的基因的表达也发生了明显改变，如Crisp1的表达下调84.4倍，Ephrina2的表达下调11.3倍。 另外还有较多以前以为与毛发生长发育没有关系的基因的表达也发生了明显的变化，如果对这些基因进行进一步的研究可能会发现一些新的与毛发生长发育有关的基因。 小结1.阐明了CK-794引起小鼠毛发异常的表型及发生发展的特征。当给药量在10.0mg/kg时，仔鼠在整个药物接触时间内肉眼未见明显的毛发生长，在显微镜下观察发现背部只有一种弯曲而细小的毛发。在停药后，毛发生长会恢复。 2.建立了两种品系小鼠毛发生长发育异常的动物模型。 ①CK-794可影响各种类型毛发的生长发育，但对粗毛发(awl、guard)的影响更大。②毛发异常发生率及程度有明显的剂量-反应关系。③CK-794在孕期及哺乳期给药时都会对仔鼠的毛发产生影响，在哺乳期的作用更为明显。④毛发异常具有可逆性，停止接触CK-794后毛发的生长发育逐渐恢复正常。⑤CK-794引起的毛发异常无遗传性。⑥CK-794引起ICR和C57BL/6小鼠发生毛发异常所需的剂量及毛发异常表型相似。 3.用基因芯片对10.0mg/kg及对照组的仔鼠背部皮肤毛囊组织中的基因表达情况进行了初步分析，发现大部分编码构成毛发的蛋白质的相应基因(Krt及Krtap)在给药组仔鼠的皮肤毛囊组织中的表达明显下调，而且参与Krt及Krtap的表达调控的基因也发生了明显变化。

目录

文摘

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英文详细摘要

前 言

第一部分CK-794致ICR小鼠毛发生长发育异常动物模型的建立

第二部分Ck-794致C57BL/6小鼠毛发生长发育异常动物模型的建立

第三部分CK-794致小鼠毛发生长发育异常仔鼠皮肤毛囊组织基因表达谱分析

小 结

致 谢

信号转导途径与毛发生长发育