乙型肝炎病毒相关慢性肝炎、肝硬化及原发性肝癌的血清蛋白组学研究

摘要

目的：旨在利用Ciphergen公司的蛋白质芯片飞行时间质谱仪系统，选择弱阳离子交换芯片(wcak cationic exchanger,WCX，CM10芯片为WCX芯片表面加上一层疏水膜，可以结合更多的蛋白，故实验中选用CM10芯片)，检测HBV相关慢性肝炎、肝炎肝硬化及原发性肝癌患者血清的蛋白质表达谱，分析各组蛋白质图谱差异，以期发现慢性肝病进展过程中不同阶段的差异性蛋白。并对各组蛋白质图谱进行聚类分析，通过决策树建立疾病预测模型。为进一步明确差异蛋白的特性及功能，将其分离、纯化后在芯片上进行原位酶解，对差异蛋白进行鉴定及功能分析，以探讨其在乙型肝炎病毒相关慢性肝病中的作用，早期发现疾病的进展，寻找阻断慢性肝炎向肝硬化、肝癌发展的新思路。 实验方法： 采用美国Ciphergen Biosystems公司的蛋白质生物芯片表面增强激光解析电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术和PBS Ⅱ-C型蛋白质芯片阅读机，通过弱阳离子交换芯片(CM10)对32例正常人、85例HBV相关慢性肝炎、30例HBV相关肝硬化和26例HBV相关肝癌术前患者的血清分别进行检测并读取数据，获得血清蛋白指纹图谱，对得到的蛋白质图谱，使用Ciphergen Biosystems软件3.1.1版本及Biomarker Wizard软件进行分析、比较，以寻找慢性肝病进展过程中的差异蛋白。对正常、慢性肝炎、肝硬化及原发性肝癌患者血清图谱进行聚类分析，通过决策树建立疾病预测模型。进一步将肝癌患者及对照组血清通过U9、U1处理后，上离子交换柱，用不同pH Tris缓冲液洗脱，收集各组分；用NP20芯片挑选含有特征峰的组分，然后用CM10芯片验证含有特征峰的组分，芯片原位酶解后，PMF质谱鉴定。 实验结果： 由CM10芯片共检测到294个有效的蛋白质波峰，其中m/z值在1000～10000Da之间有253个；10000～20000 Da之间有23个；20000～30000 Da之间有18个。经分析，在正常对照、HBV相关慢性肝炎、肝硬化和肝癌组之间有18个差异蛋白峰(P<0.05)，其中差异最显著的质荷比为5805 Da的蛋白质峰在由正常对照、慢性肝炎、肝硬化至肝癌的疾病进展过程中表达量呈递增趋势，在肝癌组表达最高；质荷比为13260 Da的蛋白质峰在这个过程中呈递减趋势，在肝癌组表达最低。通过聚类分析同样发现质荷比为5805 Da的蛋白在正常、慢性肝炎、肝硬化和肝癌组间呈正相关，在肝癌组密度(即强度)最高。通过决策树建立疾病预测模型，对乙型肝炎病毒相关慢性肝病预测的平均正确率达73.9％。 对差异最显著的质荷比为5805 Da的蛋白通过离子交换柱分离、纯化，在芯片上进行原位酶解，PMF质谱鉴定，SWISS-PROT数据库搜库检索，该蛋白鉴定为硫酸软骨素合酶Ⅱ，属于软骨素N-乙酰半乳糖胺基转移酶家族。 结论： 1．正常对照、乙型肝炎病毒相关慢性肝炎、肝硬化与肝癌组间血清蛋白图谱表达差异显著。 2．正常对照、乙型肝炎病毒相关慢性肝炎、肝硬化与肝癌组间有18个差异蛋白质峰，其中质荷比为5805 Da的蛋白峰在慢性肝炎、肝硬化、肝癌血清中含量逐渐增高。 3．质荷比为5805 Da的蛋白经质谱鉴定为硫酸软骨素合酶Ⅱ。 4．硫酸软骨素合酶Ⅱ可能在乙型肝炎病毒相关慢性肝炎、肝硬化及肝癌的发病过程中发挥重要作用，可望成为疾病进程中的血清学分子标记。 5．通过决策树建立疾病预测模型，对乙型肝炎病毒相关慢性肝病预测的平均正确率达73.9％。

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论文说明：中英文缩略语对照表

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摘要

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第一部分 慢性肝炎、肝炎肝硬化和肝癌血清中差异蛋白的筛选

前言

材料和方法

结果

讨论

第二部分 慢性肝炎、肝炎肝硬化和肝癌疾病预测模型的研究

前言

材料和方法

结果

讨论

第三部分 慢性肝炎、肝炎肝硬化和肝癌血清中差异蛋白的鉴定

前言

材料和方法

结果

讨论

全文总结

参考文献

综述 表面增强激光解析电离质谱在筛选肿瘤标记物方面的进展

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