脊柱浆细胞骨髓瘤骨病预后相关因子筛选及Cox模型构建

摘要

背景：浆细胞骨髓瘤(plasma cell myeloma,PCM)是一种B细胞恶性肿瘤,常常以骨髓被分泌Ig的恶性浆细胞侵犯和溶骨性损害为表现。PCM主要分为孤立性浆细胞瘤和多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)两大类,组织学上PCM属于血液系统恶性肿瘤,其发生率仅次于非何杰金淋巴瘤。骨髓瘤细胞主要生长在骨髓中,破坏骨质,尤其好发生在脊椎骨、肋骨和头颅骨等扁骨上,从而形成骨髓瘤骨病(myeloma bone disease,MBD)。由于MBD起病隐匿,临床表现复杂多样,常常是以骨痛,骨折为首发表现,发生于脊柱的浆细胞骨髓瘤破坏脊柱骨质,造成椎节塌陷、不稳及脊髓神经受压,导致顽固性疼痛、脊髓神经功能障碍和瘫痪,严重影响患者生活质量和生存期。其骨破坏机制的关键在于破骨细胞被激活的同时成骨细胞活性受抑,最终造成骨代谢失衡。骨髓瘤高度的侵袭性和较差的预后,一直是骨髓瘤研究领域的关注热点。近年来,脊柱浆细胞骨髓瘤发病率有逐年攀升趋势。尽管骨髓瘤治疗仍以内科全身化疗为主,但对于发生于脊柱的PCM,外科手术治疗作为一种重要手段,在切除病灶、解除神经压迫、恢复脊柱稳定方面具有不可替代的作用。然而,由于脊柱MBD患者生存期有限,手术治疗依然是目前争论较多的领域,五年生存率较低,治疗策略的制定尤为棘手。事实证明不适当的治疗方案,不仅无助于延长患者生存期,而且不利于改善患者在有限的生存期内的生存质量,同时也给社会造成不必要的经济负担。预后判断是正确制定脊柱浆细胞骨髓瘤治疗策略的关键所在。而现行的临床评估系统对于患者的预后评判尚不够准确,多涉及临床观察的大体指标,主要依据医生的个人经验和主观判断,缺乏有关分子生物学评判指标。 随着分子生物学的发展,骨髓瘤骨病分子生物学研究取得很大进展。国内外肿瘤相关基因的研究已有了较大的进展。大量研究表明,肿瘤相关基因的突变、扩增及过表达等改变常与肿瘤的预后密切相关。在乳腺癌、肺癌、肝癌等实体瘤的研究已相继发现了与之预后紧密相关的分子标志物,并成功应用于临床预后判断,有的甚至在后续研究中成为新治疗方法的靶点。然而相关研究在骨髓瘤骨病中尚不太多,关注于脊柱MBD的则更为罕见。 目的：检测脊柱浆细胞瘤中肿瘤增殖调控相关基因Cyclin D1、Survivin和CD20以及肿瘤扩散转移相关基因MMP-2、MMP-9、TIMP-2、OPN、E-cadherin、CD56和VEGF的表达情况；探讨相关基因表达及临床指标与脊柱浆细胞骨髓瘤预后的关系,建立脊柱浆细胞骨髓瘤预后的Cox模型。 方法：收集选取1998年1月至2007年4月间长征医院病理科脊柱骨髓瘤手术后石蜡包埋组织块,并收集相关科室临床及随访资料。采用免疫组织化学SP法,检测肿瘤扩散转移相关基因MMP-2、MMP-9、TIMP-2、OPN、E-cadherin、CD56和VEGF以及肿瘤增殖调控相关基因Cyclin D1、Survivin和CD20在脊柱浆细胞骨髓瘤组织中的表达,观察、评定各基因蛋白阳性表达率及表达强度。应用SPSS统计软件分析各基因表达相互间关系及与脊柱浆细胞骨髓瘤生物学行为的关系,Kaplan-Meier生存分析及Log-Rank时序检验分析各基因表达与脊柱浆细胞骨髓瘤骨病预后的关系,筛选脊柱浆细胞骨髓瘤骨病预后相关基因。采用Cox前向逐步回归法分析预后相关基因和临床指标的回归系数,建立脊柱浆细胞骨髓瘤骨病预后评估的Cox模型。 结果：1.(1)扩散转移相关因子在脊柱浆细胞骨髓瘤组织中的阳性表达率MMP-2为63.4％,MMP-9为95.1％,TIMP-2为100％(其中高表达率为75.6％),OPN为82.9％,E-cadhrerin为46.3％,CD56为80.5％,VEGF为100％(其中高表达率为78.0％)。MMP-2、MMP-9、TIMP-2与CD56的表达程度与脊柱MBD患者的临床分型、病理形态学分型、M蛋白分型、轻链分型、年龄和性别均无显著相关性(P>0.05)。OPN蛋白在的表达程度在M蛋白分型各组之间和轻链分型各组之间均有显著差异(P<0.05),其阳性表达率在M蛋白分型各组间关系为：未分泌组=IgG型组>IgA型组>其它类型组；在轻链分型各组间关系为：未分泌组>λ型组>k型组；而其阳性表达与患者临床分型、病理形态学分型、年龄和性别无显著关系(P>0.05)。VEGF蛋白在的表达程度在M蛋白分型各组之间有显著差异(P<0.05),其高表达率具体为IgA型组>未分泌组>其它类型组>IgG型组；而其表达程度与患者临床分型、病理形态学分型、轻链分型、年龄和性别无显著关系(P>0.05)。(2)肿瘤增殖调控相关基因在脊柱MBD的阳性表达率Cyclin D1为17.2％,CD20为31.7％,Survivin为100％(其中高表达率为85.4％)。Survivin蛋白的表达程度在轻链分型各组之间有显著差异(PK型组>入型组。而其表达程度与患者临床分型、病理形态学分型、M蛋白分型、年龄和性别无显著关系(P>0.05)。CyclinD1和CD20的表达与脊柱MBD患者的临床分型、病理形态学分型、M蛋白分型、轻链分型、年龄和性别均无显著相关性(P>0.05)。2.OPN与CD56之间；VEGF与E-cadherin之间；CD20与MMP-9之间,蛋白表达具有关联性(P<0.05)。MMP-2、TIMP-2、CydinD1和Survivin表达程度相互之间无显著差异(P>0.05)。3.(1)扩散转移相关因子OPN、E-cadherin和CD56阳性表达组患者生存期明显高于阴性表达者(P<0.05)。MMP-2、MMP-9、TIMP-2和VEGF阳性表达脊柱MBD患者生存期与阴性表达者无显著差异(P>0.05);(2)肿瘤增殖相关因子CD20阳性表达组患者生存期明显低于阴性表达者(P<0.05)。Cyclin D1和Survivin阳性表达脊柱MBD患者生存期与阴性表达者无显著差异(P>0.05)。4.病理形态学分级和OPN、CD20表达水平进入最终Cox预后评估模型,预后指数判断预后有较好的吻合率。 结论：1.多基因异常表达参与了脊柱浆细胞骨髓瘤的发生、发展过程,部分基因表达不仅作用于各自通路,还存在相互影响,形成复杂的调控网络促进或抑制肿瘤的侵袭、转移。2.OPN蛋白的表达程度与PCM轻链分型以及M蛋白分型有关；VEGF蛋白在的表达程度与PCM免疫球蛋白分型有关；Survivin蛋白在的表达程度与PCM轻链分型有关。3.MMP-2、MMP-9、TIMP-2、VEGF、Cyclin D1和Survivin表达与脊柱浆细胞骨髓瘤预后无显著关联,不能作为独立指标评判脊柱浆细胞骨髓瘤的预后。OPN、E-cadherin和CD56的表达下调以及CD20的表达上调与脊柱浆细胞骨髓瘤不良预后有关,可作为判断脊柱浆细胞骨髓瘤预后的分子生物学参考指标。4.病理形态学分级和OPN、CD20表达水平是影响脊柱浆细胞骨髓瘤预后的主要因素。预后指数可用于预后判断,高预后指数预示危险度增大,生存期缩短。

目录

论文说明：英文缩略词表

声明

摘要

前 言

第一部分 预后相关基因在脊柱浆细胞骨髓瘤中的表达及意义

引 言

材料和方法

结 果

讨 论

结 论

附 图

参考文献

第二部分 脊柱MBD预后的多因素分析及Cox模型构建

引 言

材料和方法

结 果

讨 论

结 论

附 图

参考文献

第三部分 石蜡包埋组织块中抽提小片段RNA的方法研究

引 言

材料和方法

结 果

讨 论

参考文献

附 录

文献综述 多发性骨髓瘤发病机制研究新进展

在读期间发表论文和参加科研工作情况说明

致 谢