促肾上腺皮质素释放激素对人足月妊娠子宫平滑肌大电导钙敏感钾通道的调节

摘要

[目的和意义]: 人类分娩的发动至今仍是个迷,早产是导致新生儿发病率和死亡率的主要病因。虽然目前有许多治疗方法,而且很多研究已经尝试新的治疗方案来阻止早产,但在过去三十年里早产的发病率并没有显著的变化。足月分娩和早产的发动机制仍然不为人类所知。但我们所能观察到是分娩发动和早产的第一步-子宫平滑肌的收缩。 足月子宫平滑肌的收缩由许多生理信号所触发,这些信号最终通过子宫平滑肌细胞离子通道的调节使得子宫兴奋。大电导钙敏感钾通道(1arge-conductancecalcium-sensitive potassium channel,BKca)是人类妊娠和非妊娠子宫平滑肌细胞上最主要的钾通道,总外向钾电流的80％为BKCa电流。BKca是目前所知道的唯一通过膜去极化和增加细胞内Ca2+浓度而被激活的离子通道,它能使子宫平滑肌静息,在调节子宫平滑肌功能中起着枢纽的作用。平滑肌BKca由α亚单位和β亚单位组成的四聚体结构构成。α亚单位形成通道的孔道区,β亚单位是决定了通道Ca2+的敏感性。 促肾上腺皮质激素释放激素(Cortieotropin-Releasing Hormone,CRH)是人类分娩时所特有的激素,近年来认为促肾上腺皮质激素释放激素是控制妊娠时间长短的“胎盘钟”。在妊娠初期母体血浆的CRH浓度很低,妊娠中期开始上升,分娩时显著增加。提高母体CRH水平会引起早产提示CRH可能参与了子宫平滑肌的收缩。然而,CRH又可通过增加子宫平滑肌细胞内的环磷腺苷,继发的减少细胞内钙的水平又起到使子宫静息的角色。CRH在妊娠的不同阶段,发挥着保持子宫静息和促进子宫收缩的双重作用。 目前对BKea通道的调节因素还未研究完善,已有的研究提示PH值、还原电位、-氧化氮、花生四稀酸以及磷酸化作用可能对BKea有影响。孕期母体血CRH进行性升高,CRH是否对通过对BKca离子通道影响进而影响子宫平滑肌舒缩呢?所以,为了解子宫平滑肌细胞的BKca的表达情况是否受到CRH的调节,在实验室以往工作的基础上,设计进行了此研究,探讨CRH影响子宫舒缩的机制,期望为控制子宫平滑肌收缩提供一个靶点。 [实验方法和统计学处理]： 1、分离和培养人子宫平滑肌细胞：术中取少量足月临产(term labor,TL)及足月未临产(term non-labor,TNL)的子宫下段平滑肌,Ⅱ型胶原酶及DNA酶共同消化细胞并进行原代培养。 2、反转录、实时定量多聚酶链反应：给予细胞不同浓度的CRH和CRH R1受体拮抗剂、R1受体拮抗剂、CRH广谱拮抗剂以及CRH拮抗剂和CRH的合剂作用24h后,利用上海华舜公司Trizol Reagent并按照制造商提供的方法,提取细胞的总RNA,利用Promega公司的反转录酶M-MLV,按制造商提供的方法,合成cDNA第-条链。设计合成actin(内参照)及BKca α亚单位及β亚单位(目的基因)的引物,进行实时定量PCR,扩增BKca α亚单位及β亚单位DNA双链,检测子宫平滑肌细胞BKca α亚单位及β亚单位mRNA的相对表达量。 3、统计学处理：以actin为内参照,将BKca与actin的cDNA和蛋白浓度的比值反映BKca的mRNA和蛋白的相对表达量。以SPSS 13.0进行统计。建立数据库后,统计、描述各组数据的均数、标准误并对数据进行方差齐性检验,若数据呈正态分布且方差齐性,则对其采用one way ANOVA,比较各组均数之间是否有差别；对于非正态分布或方差不齐的样本则采用非参数检验(Kruskal Wallis Test)。检验水准α=0.05。 [结果]： 1、联合使用胶原酶和DNA酶消化法可快速获得活力较好的子宫平滑肌细胞。 2、足月未临产组(TNL)CRH及其受体拮抗剂作用24h后子宫平滑肌细胞中BKca α亚单位mRNA的表达水平统计分析在未临产组,与空白对照组相比,各处理组使BKCa通道α亚单位mRNA表达升高,各组之间有差异(p=0.047)。 CRH处理组相互比较：两两比较,10-8 mol/L浓度的CRH与空白对照组相比,差异有统计学意义(p=0.015);10-7 mol/L浓度的CRH与空白对照组相比,差异显著(p=0.003)：10-10 mol/L和10-9 mol/L浓度的CRH与对照组相比,差异无统计学意义(p=0.073,0.266)。 CRH R1及R2受体拮抗剂处理组与空白对照组相比,在单独给予CRH R1受体拮抗剂Antalarmin或CRH R2受体拮抗剂Astressin 2B后,BKca α亚单位mRNA表达也上调,但此差异无统计学意义(p=0.558,0.084)。与CRH 10-9mol/L组对比,在给予CRH 10-9mol/L+Antalarmin 10-7 mol/L组和CRH 10-9 mol/L+Astressin 2B 10-7mol/L组后,并没有逆转CRH 10-9 mol/L的效应,此结果也无统计学意义(p=0.050,0.901)。与空白对照组相比,R1受体拮抗剂溶剂DMSO使BKCa α亚单位mRNA表达也上调,此差异有统计学意义(p=0.022)。 3、足月临产组(TL)CRH及其受体拮抗剂作用24 h后子宫平滑肌细胞中BKCaα亚单位mRNA的表达水平统计分析在临产组,与空白对照组相比,各处理组使BKCa通道α亚单位mRNA表达升高,但各组之间差异均无统计学意义(p=0.904)。 CRH处理组相互比较：两两比较,10-10 mol/L、10-9 mol/L、10-8 mol/L和10-7mol/L浓度的CRH与空白对照组相比,差异无统计学意义(p=0.276,0.691,0.618,0.889);CRH各浓度之间相互比较差异无统计学意义(P>0.05)。 CRH广谱受体拮抗剂与空白对照组相比,在单独给予CRH广谱受体拮抗剂Astressin后,BKCa α亚单位mRNA表达也上调,但此差异无统计学意义(p=0.306);与CRH 10-9 mol/L组对比,在给予CRH 10-9 mol/L+Astressin 10-8 mol/L组后,并没有逆转CRH 10-9 mol/L的上调效应,结果无统计学意义(p=0.899)。 4、足月未临产组(TNL)CRH及其受体拮抗剂作用24 h后子宫平滑肌细胞中BKCa β亚单位mRNA的表达水平统计分析在未临产组,与空白对照组相比,各处理组对BKCa通道β亚单位mRNA表达差异无统计学意义(p=0.940)。 CRH处理组相互比较：与空白对照组相比,10-10mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L浓度的CRH对BKCa通道β亚单位mRNA表达上调,但此差异无统计学意义(p=0.698,0.714,0.480);与空白对照组(100±0)相比,10-9mol/L浓度的CRH使BKCa通道β亚单位mRNA表达下调,此差异无统计学意义(p=0.912)。 CRH R1及R2受体拮抗剂处理组与空白对照组相比,在单独给予CRH R1受体拮抗剂Antalarmin或CRH R2受体拮抗剂Astressin 2B后,BKCa β亚单位mRNA表达下调,但此差异无统计学意义(p=0.903,0.939)。与CRH 10-9 mol/L组对比,在给予CRH 10-9 mol/L+Antalarmin 10-7 mol/L组和CRH 10-9 mol/L+Astrcssin 2B 10-7mol/L组后,并没有逆转CRH 10-9 mol/L的上调效应,此结果也无统计学意义(p=0.282,0.496)。与空白对照组相比,R1受体拮抗剂溶剂DMSO使BKCa β亚单位mRNA表达上调,此差异无统计学意义(p=0.562)。 5、足月临产组(TL)CRH及其受体拮抗剂作用24 h后子宫平滑肌细胞中BKCaβ亚单位mRNA的表达水平统计分析在临产组,与空白对照组相比,各处理组使BKca通道β亚单位mRNA表达有统计学意义(p=0.027)。 CRH处理组相互比较：两两比较,10-8 mol/L浓度的CRH与空白对照组相比,使BKCa通道β亚单位mRNA表达下调,差异有统计学意义(p=0.045);10-7 mol/L浓度的CRH与空白对照组相比,差异有统计学意义(p=0.032);10-10 mol/L和10-9mol/L浓度的CRH与对照组相比,差异无统计学意义(p=0.781,0.864)。 CRH广谱受体拮抗剂与空白对照组相比,在单独给予CRH广谱受体拮抗剂Astressin后,BKCaβ亚单位mRNA表达上调,但此差异无统计学意义(p=0.655);与CRH 10-9 mol/L组对比,在给予CRH 10-9 mol/L+Astrcssin 10-8 mol/L组后,并没有逆转CRH 10-9 mol/L的上调效应,结果无统计学意义(p=0.653) [结论]： 1、人足月妊娠子宫平滑肌细胞BKCa的表达受到一定浓度范围(10-8 mol/L～10-7mol/L)CRH的调节。 2、CRH对子宫平滑肌BKCa起着双重调节作用：足月未临产时CRH能上调BKCaα亚单位,发挥维持子宫静息作用。足月临产时下调BKCaβ亚单位,使得BKCa静息功能减弱或消失,可能引发了子宫的收缩。

目录

论文说明：缩略词表

声明

摘要

前言

第一部分人足月妊娠子宫平滑肌细胞的原代培养

第二部分CRH及其受体拮抗剂对人足月妊娠子宫平滑肌细胞大电导钙敏感钾通道(BKca)的调节

第一节CRH其受体拮抗剂对人足月妊娠子宫平滑肌细胞BKcaα亚单位mRNA的调节

第二节CRH及其受体拮抗剂对人足月妊娠子宫平滑肌细胞BKcaβ亚单位mRNA的调节

讨论

结论

参考文献

附录 CRH对人足月未临产妊娠子宫平滑肌细胞BKcaα亚单位蛋白的调节

综述：妊娠子宫平滑肌钾离子通道的功能和调节

在读期间文章撰写情况及科研工作情况说明

致 谢