骨软骨组织体外培养保存方法的探索

摘要

目的：通过对4℃和37℃温度条件以及保存过程中是否更换培养液对软骨细胞活性影响的比较选出适合液体培养保存骨软骨组织的温度和液体处理条件。再观察加入了EGCG与IGF-I的培养液对细胞活性的影响，以探索培养液的有效成份，为进一步寻找最佳的培养液提供指导。
　　 方法：第一部分：不同保存温度及换液与否的比较。以羊踝关节软骨为实验材料，将获取的同样大小的踝关节骨软骨块120枚经过无菌PBS液冲洗后随机分配到4组相同的无菌培养瓶中，分别向这四组瓶中加入相同的基础培养液，成份为89％EMEM培养液、10％胎牛血清(FBS)和1％的青链霉素(各100UI/ml)，标准为没过组织块0.5cm。根据保存方式的不同将其分为A、B、C、D四个组，其中A组保存于4℃冰箱中，每隔两天换液一次；B组保存于4℃冰箱中，保存全程不换液；C组保存于37℃，5％CO2培养箱中，每隔两天换液一次；D组保存于37℃，5％CO2培养箱中，保存全程不换液。分别于保存第7、21、35天每组取出10块进行检测，检测项目包括EB/FDA双荧光法测细胞存活率、HE、番红-O染色，观察并比较各组之间在不同时间点细胞存活率和活性的区别。第二部分：EGCG、IGF-I及其共同作用对液体保存骨软骨组织的影响。同样以羊踝关节软骨为实验材料，取180枚骨软骨块经过与上一步同样的处理后随机分配到4组相同的无菌培养瓶中，并根据培养液成份的不同将其分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四个组，其中Ⅰ组培养液成份为与第一部分实验相同的基础培养液；Ⅱ组为基础培养液加.100ng/ml的IGF-Ⅰ；Ⅲ组为基础培养液加0.01mmol/L的EGCG；Ⅳ组为基础培养液同时加入100ng/ml的IGF-Ⅰ和0.01mmol/L的EGCG。将这四组培养瓶保存于第一步得出的最佳温度与液体处理条件中。分别检测新鲜、7天、21天、42天、56天之后组织细胞的存活率、HE、番红-O染色及Ⅱ型胶原SABC-FITC免疫荧光染色。分析各组保存效果。
　　 结果：第一部分，除保存7天时温度因素，以及温度与液体处理两因素交互作用对细胞存活率没有影响之外，其余各时间点的温度因素、液体处理因素及温度与液体处理两因素交互作用都对细胞存活率的变化产生了影响，其中保存7天、21天、35天时细胞存活率最高值分别为90.88±3.69％、88.31±3.93％、78.69±8.56％，均出现在4℃条件下换液保存组。对各组番红-O的分析除了保存7天时A组IOD值明显高于其他三组外，其他保存时间点IOD值组间比较无显著差异。各组保存效果随着时间的延长出现了明显的下降趋势，且下降速率从保存21天起迅速增加。因此，4℃条件下换液保存法保存骨软骨组织效果比37℃、不换液效果好。第二部分，保存7天时，基础培养液组(Ⅰ)、基础培养液+IGF-Ⅰ组(Ⅱ)、基础培养液+EGCG组(Ⅲ)细胞存活率组间无明显差别，均从新鲜的87.45±3.59％降至81％左右，基础培养液+EGCG+IGF-Ⅰ组(Ⅳ)为63.72±12.42％，出现明显下降；保存21天时，后二组细胞存活率下降明显，分别低至70.17±3.88％和64.69±5.63％，明显低于前两组的78.58±3.10％和80.41±3.87％；保存42天和56天时，各组各检测指标均出现大幅下降，降至20％左右，组间差别不大，已无分析意义。对番红-O染色和Ⅱ型胶原染色也表现出了相同的差别与变化趋势。各组保存效果随着时间的延长出现了明显的下降趋势，且下降速率从保存21天起迅速增加。因此，培养液中加入100ng/ml的IGF-Ⅰ没有对体外培养保存骨软骨组织的效果产生有益的作用，加入0.01mmol/L的EGCG和两种因子同时加入对保存效果产生了有害作用。
　　 结论：⑴采用4℃条件下保存、每隔2天进行一次换液的处理方式体外液体培养保存骨软骨组织效果比37℃、不换液的方式好；⑵培养液中加入100ng/ml的IGF-Ⅰ没有对体外培养保存骨软骨组织的效果产生有益的作用，加入0.01mmol/L的EGCG和两种因子同时加入对保存效果产生了有害作用。