新西兰兔异体静脉间置移植模型的建立和4℃UW液保存异体血管的实验研究

摘要

研究背景： 自上世纪初人们便开始了对器官移植的漫长探索，20世纪50年代血管吻合技术的成熟和80年代高效免疫抑制剂的迅速发展才使器官移植学科异军突起，迄今为止，心脏、肝脏、肾脏等重要实体脏器的临床移植治疗已经形成了完善的学科体系。 实体器官移植最关键的手术步骤在于将被移植器官的血管系统重建。肝脏具有复杂的肝动脉、门静脉和肝静脉系统，它们的正常解剖结构对肝脏功能都是不可缺少的。无论是尸体肝移植还是活体肝移植，肝动脉、门静脉和肝静脉的重建过程均是肝移植手术成败与否的关键。肝血管在重建的过程中，可能会出现供受体血管不匹配、血管变异以及血管病变等情况，就需要利用血管替代物进行血管整形来完成血流重建；其它临床领域，如外周血管和冠状血管阻塞性疾病的外科治疗也会使用血管替代物重建堵塞血管。随着近年来血管外科和器官移植外科的发展，在过去的20年内临床上对血管替代物的需求越来越多。这些血管替代物可分为3类：自体血管，异体血管和人工血管。自体血管由于获取受限，应用范围狭窄；人造血管则因造价昂贵及可能导致致死性感染并发症，难以普及推广；而异体血管可随器官供体大量获取，组织保存技术的进步也促使血管库的不断完善，因此，近20年以来人们对直径小于6mm血管移植更多的使用了异体血管。 异体血管现有的保存方法有深低温冻存(-150℃或-196℃)、低温冷保存法(0-4℃)和戊二醛保存[4]。深低温冻存需要特定的保存液、抗冻剂和昂贵的深低温设备，冻存血管升、降温速率必须控制在一定范围内，速率过快会造成组织碎裂和细胞死亡，这样的降温、复温必然耗时漫长，操作繁琐。但是其保存、解冻和操作流程已经形成了规范，是目前血管组织库保存血管的标准方法。而所有临床应用戊二醛保存方法的均是针对以入脐静脉(human umbilical vein，HUV)为研究目的的复合血管，脐静脉经戊二醛酸化处理后在血管外覆盖一层Dacron网状物并长时间保存在50％酒精中，在绝大多数的相关文献中并没有对戊二醛保存的方法进行详细描述。这两种保存方法的效果十分良好，然而在器官移植外科由于存在供体血管变异的不可预知性和术中情况的复杂性，针对血管替代物的需求也是难以预知和非常迫切的。对于有大量和稳定来源的尸体异体血管，我们仅仅需要在短期内有效保存它们便可以完全满足移植外科对血管替代物的需要，那么建立一个成本低廉、操作简便的临时血管库将十分具有应用价值，0-4℃条件下的冷保存方法具备了以上要求。冷保存的保存液大致分为盐溶液和营养液两种，在目前的临床应用中异体血管冷保存均是采用盐溶液，文献报道有效保存时间可长达10-21天。UW液作为实体器官保存液，特别是肝脏，集成了盐溶液和营养液的优势，对一般实体脏器的细胞保存效果良好。但是对血管组织和内皮细胞保存效果的系统实验研究尚未见文献报道。 基于以上研究背景，我们设计了以UW液为保存媒介的异体血管冷保存方法的动物实验和临床研究。本课题立足临床应用，存新西兰兔上建立异体静脉移植模型，并观察UW液保存组和盐溶液保存组的移植物效果对比，对离体保存的异体血管，通过伊文思蓝染色、细胞增殖反应实验和Western blot等方法观察经两种保存液保存后的血管内皮细胞完整性、增殖能力和功能性蛋白表达。临床上通过观察活体肝移植患者采用改良方法保存的异体静脉完成肝静脉分支重建的术后不同时间血管移植物通畅率来评估Uw液保存异体血管的临床应用价值。本课题旨在探讨UW液在低温冷保存异体血管中的优势和对血管组织的保护效能，为临床使用UW液冷保存的异体血管和建立简易血管库提供新方法和实验依据。 一、新西兰免异体静脉间置移植模型的建立 目的： 1．探讨新西兰兔静脉间置血管移植模型的建立技巧及方法： 2．比较不同创立方法间的优缺点。 方法： 选取体重在3.5-4.5公斤的雄性新西兰兔作为受试对象。分别选取受试动物的颈静脉(内径约4mm)和下腔静脉(内径约6mm)作为血管吻合部位，使用兔的同种异体下腔静脉血管条段(长约7-10mm)作为间置血管进行静脉端．端吻合来完成动物模型，比较两种方法在手术时间、血管阻断时间、动物存活率以及血管移植物通畅率上的差异。 结论： 采用新西兰兔颈静脉和下腔静脉部位进行静脉移植物的血管端。端吻合方法均是简单、易行和安全的异体静脉移植动物模型，两种方法各具优点，对动物存活率、移植血管通畅率等方面无显著影响，均是可以检验血管保存效果的理想模犁。 二、不同保存方法和不同保存时间的异体静脉移植物在动物体内的效果观察 目的： 1．通过新西兰兔颈静脉部位的异体静脉移植模型来探讨UW液和盐溶液两种冷保存方法的保存效果； 2．探讨使用UW液冷保存法是否优于盐溶液冷保存法。 方法： 1．获取新西兰兔的下腔静脉条段作为待移植的异体血管，分别用UW液和PBS液在4℃条件下冷保存1周、2周、3周及4周； 2．存新西兰兔左侧颈静脉上移植入PBS液保存的异体静脉，而在右侧植入UW液保存相同时间的异体静脉，每一个保存时间段各完成15例模型； 3．观察血管移植术后近、远期动物的存活情况和静脉移植物的通畅情况，使用Fisher精确概率法和CMH X2检验方法比较这些结果在不同保存方法和不同保存时间组之间的差别。 结论： 1. 4℃UW液保存异体血管是一种安全、有效的方法； 2．Uw液冷保存异体血管的效能高于一般盐溶液； 3．UW液可有效保存异体静脉长达3周，盐溶液的有效保存时间小超过2周； 4．UW液保存的异体血管近期通畅率较为理想，但是远期通畅率出于各种原因不甚满意，尚需要进一步深入研究； 5．对仅要求短期内建立血流通道的血管替代物来说，UW液冷保存3周之内的异体静脉效果令人满意。 三、4℃UW液对异体血管保存时限的实验研究 目的： 1．探讨血管存UW液和传统盐溶液长时间冷保存过程中组织、细胞的结构和功能改变； 2．探讨UW液冷保存法是否优于传统盐溶液冷保存法。 方法： 1．获取新西兰兔的腹主动脉条段作为待研究的血管，分别用UW液和复方乳酸钠注射液在4℃条件下冷保存1周、2周、3周及4周，新鲜血管为阴性对照，血管钳钝性破坏内皮层后的血管设为阳性对照组，用Evans blue dye(EBD)染色血管内皮15s，染色后的血管标本经甲酰胺溶液处理后沈脱EBD，上清液测吸光值(波长620nm)，在EBD标准曲线上计算出各组样本中的EBD含量，使用BCA蛋白定量法测定每个血管条样本中的总蛋白含量，最后计算出每个样本单位蛋白质含量中的EBD含量(ng/mg)，用t检验和方差分析对不同保存方法和不同保存时间之间的比值进行统计学分析； 2．随肝肾等器官获取的同时大量扶取自愿供者的成人髂静脉和颈内静脉，无损伤方法仔细修整静脉，分别用UW液和PBS液在4℃条件下冷保存1周、2周、3周及4周。静脉内膜用0.25％Ⅰ型胶原酶溶液消化60-70min，离心后去上清即得到成人静脉内皮细胞，经细胞计数后倍比稀释分为不同细胞含量的悬浮液置入96孔板，用DMEM培养样将每孔配成100μl容积，放入37℃，5％CO2恒温箱中培养6-10小时，每孔加入10μl CCK-8，37℃，5％CO2条件下孵育2-4小时，测定小同细胞浓度的吸光值(检验波长450 nm，参比波长620nm)，以新鲜静脉的细胞数和OD值绘制标准曲线，每组样本测定OD值后在标准曲线上找出活性细胞数，并计算出内皮细胞存活率(新鲜静脉的存活率为100％)，采用Mann-Whitney U检验方法分析不同保存方法和不同保存时间的样本之间内皮细胞存活率的差异； 3．获取人静脉标本、分离内皮细胞和实验分组同方法2。各组样本所获得的内皮细胞用Western blotting免疫印迹法检测各组样本中内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的蛋白水平，观察不同保存方法和不同保存时间的样本之间eNOS水平的差异。 结论： 1．从血管内膜完整性、静脉内皮细胞活性及功能性蛋白eNOS表达量等方面来说，存4℃冷保存条件下，UW液对异体血管的有效保存时间可长达3-4周，盐溶液的有效保存时间均在2周以内； 2．在较短的保存时间(1-2周)内，UW液和盐溶液的保存效果近似； 3．UW液冷保存法要优于传统盐溶液冷保存法，这种方法可适用于建立临时、简易血管库。 四、4℃UW液保存的异体静脉移植物在成人活体肝移植肝静脉分支重建中的临床应用 目的： 探讨4℃UW液保存的异体静脉移植物在活体肝移植肝静脉重建中的临床应用结果与价值，探讨该方法是否适合建立临床简易异体血管库。 方法： 对我院全军器官移植研究所2007年06月至2008年01月完成的9例成人间右半肝活体肝移植病例，采用在4℃UW液中保存7天以内的异体静脉移植物重建供肝Ⅴ、Ⅷ段肝静脉粗大属支以及右肝下静脉的临床资料进行回顾性分析。 结论： UW液保存的异体静脉在临床活体肝移植中应用结果十分理想；采用4℃UW液保存7天以内的异体静脉移植物重建肝Ⅴ、Ⅷ段肝静脉粗大属支以及右肝下静脉是一种简单、安全和有效的活体肝移植肝静脉重建方法；UW液低温冷保存是建立器官移植外科自属简易异体血管库的理想选择。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

第一部分新西兰兔异体静脉间置移植模型的建立

一、材料和方法

二、实验结果

三、讨论

四、结论

参考文献

第二部分不同保存方法和不同保存时间的异体静脉移植物在动物体内的效果观察

一、实验材料及实验方法

二、实验结果

三、讨论

四、结论

参考文献

第三部分4℃UW液对异体血管保存时限的实验研究

一.伊文思蓝（Evans Blue）染色观察内皮结构完整性的研究

(一)材料和方法

（二）实验结果

（三）讨 论

（四）结论

二、两种保存方法不同保存时限对成人静脉内皮细胞的影响

（一）材料及方法

（二）实验结果

（三 ）讨论

（四）结论

3.Western blot法检测两种保存方法不同保存时间的人静脉内皮细胞功能性蛋白—eNOS

（一）材料及方法

（二）实验结果

（三）讨论

（四）结论

参考文献

第四部分4℃UW液保存的异体静脉移植物在成人活体肝移植肝静脉分支重建中的临床应用

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

四、结论

参考文献

全文总结

文献综述　同种异体血移植物的各种保存方法和临床应用结果

研究生期间发表论文和参与科研情况

致 谢