淫羊藿素通过诱导肝星状细胞凋亡延缓大鼠肝纤维化进程

摘要

[研究目的]
　　 探讨淫羊藿素通过诱导活化型肝星状细胞(Hepatic stellate cells，HSCs)的生长抑制和凋亡，延缓大鼠肝纤维化进程的作用和机制。
　　 [研究方法]
　　 体外实验：以不同浓度的淫羊藿素及其溶剂分别处理肝星状细胞系HSC-T6(大鼠)、LX-2(人)和正常人肝细胞系，应用噻唑蓝测定各受试细胞的生长周期变化。应用流式细胞仪及AnnexinV-FITC染色试剂盒等技术检测淫羊藿素对HSCs的诱导凋亡效应。并采用全基因组表达谱芯片对淫羊藿素处理后的HSC-T6以及溶剂处理的HSC-T6进行全基因组表达谱的比较分析，初步检测淫羊藿素作用下HSCs凋亡的相关通路。并通过Real-time PCR及Western blot检测淫羊藿素处理后细胞内凋亡相关蛋白caspase-12、caspase-3和BAX的表达，以初步探索淫羊藿素抗肝纤维化作用及诱导活化型HSCs凋亡的分子机制。
　　 体内实验：通过胆总管结扎手术(Common bile duct ligation，CBDL)以及四氯化碳(Carbon tetrachloride，CCl4)诱导分别建立胆汁淤积性肝硬化模型和肝中毒损伤性肝硬化模型。在大鼠肝纤维化形成后，给予淫羊藿素治疗(1 mg]kg体重，3次/w，持续4 w)。治疗结束后，取大鼠右心室全血检测肝功能指标的变化，病理切片HE染色观察肝脏损伤程度。通过免疫组化α-SMA染色分析及Western blot方法检测肝脏纤维胶原积累情况及组织内活化型HSCs的分布和密度，并进一步测定肝组织羟脯氨酸(Hydroxyproline，Hyp)含量，检测淫羊藿素对胆汁淤积性肝纤维化和氧化损伤肝纤维化的缓解作用。各项数据通过(-x±s).d表示，并采用统计专业软件PASW18.0对实验数据进行统计学处理。显著性差异分析采用一维方差分析的LSD多重比较及独立样本t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。
　　 [实验结果]
　　 体外实验：HSC-T6对淫羊藿素反应敏感。淫羊藿素对HSC-T6生长的48 h半数抑制浓度(IC50)为12.8μmol/L。并且随着淫羊藿素浓度的增加，生长抑制作用逐渐增强，具有剂量依赖性。但对正常肝细胞无明显毒副作用。淫羊藿素对活化型HSCs的生长抑制主要通过诱导凋亡实现。HSC-T6与24μmol/L淫羊藿素共培养24 h后，凋亡率为20.19％，与正常培养活化型肝星状细胞比较差异显著(P＜0.05)。并伴随G2期细胞消失。淫羊藿素诱导LX-2的凋亡趋势更明显。全基因组表达谱芯片扫描结果显示，淫羊藿素诱导活化型肝星状细胞凋亡，显著改变Bcl-2家族相关凋亡基因表达，并且上调Bax、caspase-3和caspase-12等蛋白表达水平，参与线粒体凋亡通路的调控。
　　 体内实验显示：与模型组比较，淫羊藿素治疗组能够降低肝纤维化时异常升高的转氨酶水平(P＜0.05)，大鼠肝纤维化评分明显降低(P＜0.05)。Ⅰ型胶原及α-SMA染色显示模型组在肝内毛细胆管附近有大量的活化型HSCs存在。淫羊藿素组活化型HSCs数量(P＜0.05)、胶原蛋白及Hyp含量(P＜0.01)均显著下降。因此，淫羊藿素可减少纤维化肝组织中活化型HSCs的数目及胶原蛋白的堆积，延缓肝纤维化进程。淫羊藿素抗肝纤维化作用通过诱导活化型HSCs凋亡实现。
　　 [结论]
　　 1、淫羊藿素可抑制体外培养的活化型肝星状细胞系HSC-T6(大鼠)及LX-2(人)的生长，但对正常肝细胞系生长无明显抑制作用。
　　 2、淫羊藿素可诱导体外培养的活化型HSCs凋亡，但对正常肝细胞系无诱导凋亡作用。
　　 3、淫羊藿素诱导活化型HSCs凋亡可能由死亡受体信号通路及线粒体途径介导。
　　 4、淫羊藿素可减缓大鼠胆汁淤积性肝纤维化和CCl4诱导的中毒性肝纤维化的进程，改善肝功能。
　　 5、减少肝组织中活化型HSCs的数量是淫羊藿素抗肝纤维化保护作用的机制之一。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

前言

第一部分淫羊藿素诱导肝星状细胞生长抑制和凋亡实验

一、材料与方法

(一)实验材料

(二)实验方法

二、结果

(一)淫羊藿素对体外培养的HSCs形态的影响

(二)活化型HSCs对淫羊藿素反应敏感

(三)淫羊藿素对HSCs生长的影响

(四)淫羊藿素诱导活化型HSCs凋亡

三、讨论

(一)HSCs在肝纤维化发生和逆转中的作用

(二)淫羊藿素诱导体外培养的HSCs凋亡

(三)诱导活化型HSCs凋亡的中草药

第二部分淫羊藿素诱导肝星状细胞凋亡的分子机制探讨

一、材料与方法

(一)实验材料

(二)实验方法

二、结果

(一)全基因组芯片扫描结果对比

(二)淫羊藿素对HSCs中Bcl-2蛋白家族相关基因表达的影响

(三)淫羊藿素对HSCs中caspases蛋白表达的影响

三、讨论

(一)活化型HSCs凋亡相关通路研究进展

(二)淫羊藿素通过调控Bcl-2家族蛋白表达诱导HSCs凋亡

第三部分淫羊藿素治疗大鼠肝纤维化的实验研究

一、材料和方法

(一)实验材料

(二)实验方法

二、结果

(一)各组动物一般情况

(二)淫羊藿素对各组肝纤维化大鼠肝功能的影响

(三)各组肝纤维化大鼠肝脏病理组织改变情况分析

(四)淫羊藿素对大鼠肝组织中活化型HSCs分布的影响

(五)淫羊藿素对肝组织Hyp含量及Ⅰ型胶原表达的影响

三、讨论

全文小结

参考文献

综述：活化型肝星状细胞清除机制及其相关抗肝纤维化策略

在读期间发表论文和参加科研工作情况

致谢