局部植入治疗骨与关节结核药物缓释体的制备与特性研究

摘要

最近几年来的流行病学调查表明，全球结核病的发病率呈增高趋势。根据调查估计，全球现有的结核病人约2000万，我国现在患结核病的人数居世界第二位，约有结核病患者500万左右。在所有结核病患者中，患有骨与关节结核的病人约占1％～2％。随着艾滋病患病率的逐年增高和各种免疫抑制剂的使用增多，其患病人数也呈逐年递增趋势。
　　 在众多骨与关节结核病的治疗方法中，主要的方法有药物治疗和外科手术治疗两种。很多骨与关节结核的病人，尤其是有明显的骨、关节破坏并导致临床严重症状的病人，最后往往需要行病灶清除等外科手术干预。随着近年来内固定材料的发展，对于较严重的骨与关节结核病人的治疗，目前多倾向于尽早行骨结核病灶清除+植骨重建内固定术。
　　 但是，在行骨结核病灶清除后，由于骨质破坏较多，残腔骨缺损严重，往往引起临床上局部残腔重建困难，尤其是脊柱及四肢的较大的骨与关节周围的严重结核病灶。同时，局部残留的结核杆菌也容易导致骨结核复发，这可能导致自体或人工骨移植失败，引起脊柱的后突畸形或脊髓受压以及关节畸形等远期并发症。
　　 另外，在行病灶清理术后，病人仍旧需要全身同时使用多种抗结核药物，且需要很长的治疗时间，一般至少6～9个月。抗结核菌的药物的毒副作用较为明显，多种药物、长疗程的治疗，全身用药毒副作用增大，每天都要服药，病人依从性差。有鉴于此，许多研究者或骨科医生开始尝试局部放置抗结核药物。
　　 但骨关节结核病灶清除后单纯的局部放置抗结核药物，药物浓度难以控制，持续时间较短，容易被引流到体外，且由于术后体位及重力等原因，难以在残腔内全方位立体释放。因此，合成一种既具有充填重建、诱导成骨作用，又具有持续立体缓释抗结核药物作用的缓释骨替代材料支架复合体，是目前临床上行骨与关节结核病灶清除术的迫切需要。
　　 在目前常用来研究的抗结核药物缓释载体中，研究较多的是有机高分子材料。但有极高分子缓释材料机械强度低，化学稳定性差，在体内容易被生物酶降解而发生崩解释放，且其内所结合的药物难以实现零释放。就其制作合成工艺而言，其载药过程是直接将药物加压沉积于载体上，仅使载体和药物进行简单的机械性混合，药物很难均匀地分散在载体基质上。同时，所合成的有机缓释载药材料质地也不均匀，从而直接影响到药物的释放速率和浓度。
　　 介孔二氧化硅材料是一种无机材料，孔径在2～50nm 之间，具有如下特性：高比表面积，高孔容，高度有序的孔道结构，孔径和孔道结构可控，化学稳定性好，结构稳定；良好的生物兼容性和生物可降解性，孔道内外易于化学改性，可以实现良好的药物控释。由于介孔二氧化硅具有以上这些明显的优点，现已作为载药缓释材料被深入研究和使用。
　　 鉴于介孔二氧化硅为无机材料，且是一种很好的缓释药物的载体，并能较方便可靠地和无机材料支架进行有效的复合，故而成为本课题所选的缓释载体材料。
　　 由于单一使用抗结核药物容易导致菌抗药性结核杆的出现，故临床使用抗结核药物现在都采用联合用药，其中最常用的效果比较肯定且贯穿整个疗程的的两种药物是INH和RFP，有文献已经证实，将二者共同包封同时使用，药物疗效和安全性良好。
　　 对于支架材料的选择，考虑到缓释微球的结合，我们选择多孔β-磷酸三钙生物陶瓷（β-TCP）这一比较成熟的骨替代支架材料。
　　 综上所述，本实验拟将介孔二氧化硅缓释微球材料复合到多孔β-TCP组织工程骨支架材料中，并将INH和RFP 共同包封其中。而后对其进行检测和缓释性能的验证，以期望这种复合体能够在动物体内的局部立体空间内，全方位、长时间地释放所包封的抗结核药物；同时还可以起到骨缺损的充填和促进成骨，加快重建的作用。通过对合成方法的探索以及对合成材料理化性能的检测、以及其体内外释放抗结核药物特性的检测和对成骨作用的观察，为其最终能应用于临床提供理论和实验支持。
　　 实验第一部分：INH-RFP/BG-MSN/β-TCP 缓释复合体的制备及表征目的：旨在通过实验室合成INH-RFP/BG-MSN/β-TCP 复合缓释材料（CS-DDS），明确其形貌特征。方法：通过化学方法合成MSNs，在300℃条件下将其与β-TCP 复合，真空负压吸引法包封INH和RFP，而后涂覆BG，场发射扫描电镜(FE-SEM)观察分析复合材料的晶相组成、微观形貌、化学结构和热稳定性，HPLC 检测其载药率。
　　 结果：MSNs 粒子为介孔材料，主要分布在40nm 左右，介孔分布呈有序的柱状排列。
　　 介孔的表面积、孔容积及孔径大小分别为958m2/g, 0.91cm3/g和2.65nm。β-TCP 较大的孔隙结构表面可见MSNs及BG 涂布均匀、光滑，复合材料载药率高。
　　 结论：通过烧结与真空负压吸引等技术的成功合成了具有包封INH和RFP作用的/BG-MSN/β-TCP 复合缓释材料，形貌特征均匀，比表面积良好，可以其可同时装载INH和RFP两种抗结核药物，载药量满意。
　　 实验第二部分：INH-RFP/BG-MSN/β-TCP 复合缓释材料体内外缓释特性的检测
　　 目的：检测INH-RFP/BG-MSN/β-TCP 复合缓释材料（CS-DDS）在体外和新西兰兔股骨体内的药物缓释特性，评价复合材料的缓释性能。方法：将一定量的CS-DDS放置到动态更换的SBF 液中，取不同的时间点，用HPLC 法检测其对应的药物浓度，总结CS-DDS在SBF 液中的体外释放特性；将L-929细胞与CS-DDS 材料共培养，MTT 法检测其对L-929细胞活性的影响；将CS-DDS 植入新西兰大白兔的股骨中下段骨缺损及骨髓腔内，分别于第1、3、5、7、14、28、42天取静脉血及肝、肾、脾和局部骨等组织，匀浆离心萃取后取上清液用HPLC 检测对应INH和RFP的浓度，总结其体内释药特点；静脉血同时行ALT, AST, BUN及Cr值等肝肾功能指标检测,对照组用载药的β-TCP 材料；取实验组第28、42d时的CS-DDS 浸泡入SBF中，上清液(空白组用SBF 缓冲液)与结核菌一起共同培养4周，观察记录结核菌生长情况。
　　 结论：CS-DDS 无明显细胞毒性，体外有效释放可达30天，体内有效释放超过42天，其对应时间点的最终检测浓度都在对应药物的最低抑菌浓度（MIC）以上，未见明显肝、肾功能损害。该缓释材料缓释抗结核药物效果肯定，未见明显毒副作用。
　　 实验第三部分：：INH-RFP/BG-MSN/β-TCP （CS-DDS）缓释复合体对兔桡骨缺损修复的实验研究。
　　 目的：评价BG-MSN 复合后的β-TCP 骨支架材料对兔桡骨骨缺损的修复性能。
　　 方法：建立兔桡骨骨缺损的实验动物模型，将定量的BG-MSN/β-TCP 材料植入缺损部位，对照组用等量的β-TCP 材料。术后16周取材，通过大体观察、影像学观察及组织学观察评价成骨修复情况。结果：肉眼观察BG-MSN/β-TCP 充填的桡骨缺损处大量骨痂形成，缺损修复处较牢固，与单纯β-TCP组类似。X 线片发现骨缺损处BG-MSN/β-TCP组与单纯β-TCP组成骨都较为明显，缺损处骨修复效果肯定。组织切片显示BG-MSN/β-TCP组骨缺损处有明显血管及成软骨细胞和成骨细胞长入，类似β-TCP组。
　　 结论：本实验通过物理的方法将BG-MSN 加入复合到β-TCP内，形成的复合材料骨诱导成骨能力肯定，类似于β-TCP，说明其作为抗结核药物的缓释载体，在骨与关节结核行病灶清理术时，可以作为骨充填支架材料，具有良好的充填和诱导成骨能力。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:缩略词表

声明

前 言

实验第一部分：CS-DDS缓释复合体的制备及表征

实验第二部分：CS-DDS体内外释放特性

实验第三部分：BG-MSN-β-TCP复合缓释骨支架材料促进兔桡骨缺损修复的实验研究

综述 抗结核药物缓释载体的研究现状

在校期间主要科研活动和成果

致 谢

文献检索查新证明