中枢离断兔股神经干细胞源性神经元细胞移植

摘要

研究目的：周围神经缺损的修复，是世界性的难题。主要是神经生长速度慢和效应器、感受器萎缩快的矛盾。如何提高神经再生的速度和质量，寻找新的修复方法是周围神经损伤迫切需要解决的瓶颈问题。目前周围神经缺损的治疗策略，是依据周围神经损伤再生的理论，通过提供一个神经纤维再生通道、营造有利于神经纤维再生微环境等，促进神经再生的，没能解决神经快速到达效应器、感受器的问题。鉴于此，我们提出了“桥接神经元修复周围神经缺损”的设想，即通过神经元接力的方法，加快神经到达效应器、感受器的时间，减少效应器、感受器病变程度，提高神经损伤修复的效果。为验证此设想，我们实验室将种植非神经干细胞性成体干细胞源性神经元细胞构建的组织工程化神经移植于鼠、犬外周神经损伤缺损模型中，发现，支架材料上的非神经干细胞性成体干细胞源神经元细胞，可以在外周神经微环境中存活、增殖、形成突触联系，促进了神经功能的修复。但是，种植在外周神经中的成体干细胞源神经元细胞，是促进了新生轴突的生长，还是建立了与中枢以及效应器之间的连接，缺乏有力的证据。为观测非神经干细胞性成体干细胞源性神经元细胞，在外周神经微环境中能否维持神经元细胞的生理学功能，以及能否与效应器（肌肉）形成连接，本课题拟将这种神经元细胞种植于已与中枢离断的家兔股神经远端神经干内，通过研究种植细胞的演变及股四头肌的状况来评价“桥接神经元修复周围神经缺损”设想的可行性。
　　 研究方法：本实验采用了骨髓神经组织定向干细胞为种子细胞。从兔髂后上嵴获取骨髓细胞后，分离、扩增、无血清培养，并使用化学诱导的方法向神经元方向进行诱导分化。诱导48小时后，神经元及胶质细胞特异性表面标志物Nestin、β-Ⅲ tubulin、synapsin Ⅰ、S-100、GFAP的免疫细胞荧光化学染色鉴定。实验分3组。实验组，家兔右下肢在股神经皮支与肌支的交汇处上方0.5cm 处剪断神经。远侧断端，神经离断处去除1mm 神经轴索，结扎后，缝扎于腹股沟韧带上；去神经轴索处，种植1×104的诱导性神经元细胞；对照组同部位注射等量细胞培养液；假手术组，兔左下肢，手术暴露股神经。观察兔实验后肢运动情况；术后5、7、 9、11、12、14、19、23、24、26周用电刺激外周神经干的方法检查肌肉的兴奋性以及神经传导（复合肌肉动作电位，CAMP）；细胞移植后26周处死动物，取材，光镜、透射电镜观测形态结构，免疫组织化学检测NF-M、S-100、NeuN、ChAT，甲苯胺蓝染色观察髓鞘形成。
　　 实验结果：骨髓神经组织定向干细胞经无血清培养向神经元方向诱导后，细胞成团生长，部分细胞伸出轴突样突起，免疫细胞荧光化学显示神经元特异性的表面抗原Nestin、β-Ⅲ tubulin、synapsin Ⅰ表达阳性，胶质细胞特异性的表面抗原S-100、GFAP 则基本不表达。细胞移植后第5周微弱的复合肌肉动作电位（CAMP）出现，CAMP的波幅随手术恢复时间的延长而逐步增大，两者具有线性相关关系。术后26周，实验组，神经干内细胞，神经元特异性标志物NF-M、NeuN 染色阳性，少数细胞胆碱能运动神经元标志物ChAT 染色为阳性，神经胶质细胞标志物S-100染色阳性表达。实验组神经干内形成了有髓神经纤维，但是密度明显低于假手术组；实验组神经元轴突结构被雪旺细胞形成的髓鞘所包裹，髓鞘周围基板完整，在轴突结构内观察到了线粒体样细胞器，但髓鞘的厚度差别很大。
　　 结论：
　　 1.骨髓神经组织定向干细胞可以作为移植神经元细胞的来源。
　　 2.中枢离断周围神经动物模型，由于排除了中枢神经和新生轴突的影响，可以作为评价周围神经神经元细胞移植效果的动物模型。
　　 3.成体干细胞源性神经元细胞可以在外周神经的环境下存活，并维持一定神经元的特性。
　　 4.成体干细胞源性神经元细胞移植修复周围神经损伤是可行的。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

一、前言

二、材料与方法

三、实验结果

四、讨论

五、结论

参考文献

全文小结与创新点及下一步研究计划

综述 组织工程化周围神经的进展

在读期间发表论文和参加科研工作情况说明

致 谢