分泌型多肽TAT-CT3-cMyc白血病HL-60细胞的生长调节

摘要

白血病是造血系统的恶性疾病。近几年，研究人员提出，应该从分子角度重新认识白血病，开展针对信号分子激活/抑制的研究，为白血病的防治提供新的思路和方法。
　　 白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor,LIF）是一种多功能的、作用广泛的细胞因子，为IL-6细胞因子家族的一员，能够在体外抑制粒系白血病细胞（如人HL-60、U937、小鼠M1系等）的增殖。然而，由于白血病细胞增长快速并对LIF感应能力很差，机体内有限的LIF无法有效抑制白血病细胞的生长。而外源性、非生理剂量的LIF对脂肪细胞、生殖细胞和内分泌细胞等正常细胞具有显著的细胞毒性，同时干扰了细胞因子间的正常协调作用，所以LIF目前还无法直接用于疾病治疗。
　　 进一步研究显示，LIF的生物学效应是通过结合靶细胞膜上的LIF受体（LIFR）来实现的。LIFR包括两个亚基--LIFRα（gp190）和LIFRβ（gp130）。其中，LIFRα含有1239个氨基酸，胞外区由789个氨基酸构成，跨膜区由26个疏水氨基酸组成，胞内区由238个氨基酸构成。LIFRα的胞内区共有三个功能域（Box1、Box2和Box3），其主要作用结构为YXXQ（Y为酪氨酸，X为任意氨基酸，Q为谷氨酰胺），是激活细胞内信号分子的必须序列。本教研室前期工作中已证实，通过脂质体转染的方式，将LIFRα细胞内区全长序列（LIFRα-CT）和含Box3功能域的C末端序列（LIFRα-CT3）分别富集于人类急性早幼粒白血病细胞HL-60胞质中，可促进该系白血病细胞的粒细胞方向分化，并有效抑制其增殖潜力[4-9]。但无论是脂质体还是病毒等转染方式，均只能应用于体外试验，因此，研发可用于体内将LIFRα-CT3安全、高效地导入白血病细胞的方法显得非常有意义。
　　 近年研究发现，蛋白质转导结构域(Protein Transduction Domain,PTD)可将全长蛋白质、DNA、化学药物、寡核苷酸、40nm磁珠和200nm脂质体等携带入细胞/核。目前最常用的PTD是人类免疫缺陷I型病毒（HIV-1）来源的TAT蛋白片段（TAT-PTD），它具有短小、高效、无毒、快速、不影响下游分子生理功能的优良特性，但常用的原核表达体系得到的融合蛋白因缺乏转录后的剪切、翻译修饰，存在低/无生物活性的可能性。因此，要获得有活性的TAT-PTD融合蛋白需用真核表达系统。
　　 本课题的目的就是利用真核表达系统制备有活性的LIFRα-CT3融合蛋白，并通过蛋白质转导结构域(PTD)将LIFRα-CT3携带入白血病胞内/核内，观察其对白血病细胞系HL-60的作用，并探讨其机制。
　　 为此，我们采用基因重组的方法，将LIFRα-CT3、TAT-PTD、出胞信号肽（SignalSequence,ss）和融合标签cMyc克隆入真核表达载体pcDNA3.0中，成功构建了pcDNA3.0-ss-TAT-CT3-cMyc重组表达载体和对照载体pcDNA3.0-ss-CT3-cMyc；通过FuGENE6非脂质体转染法将两种载体分别转染入中国仓鼠卵巢细胞（CHO）中，RT-PCR、免疫印迹和免疫荧光检测显示，TAT-CT3-cMyc可在CHO细胞中转录和表达，表明TAT-CT3-cMyc的真核表达系统已建立成功；进一步利用Realtime-PCR筛选获得了高表达的CHO-TAT-CT3-cMyc细胞系。
　　 接着，我们将构建好的CHO-CT3-cMyc和CHO-TAT-CT3-cMyc两个细胞系大量扩增后，更换为无血清培养液，72h后，回收培养液和超声粉碎CHO细胞后的上清，0.45μm滤器过滤后，利用抗cMyc标签凝胶包被的蛋白层析柱纯化目的蛋白，SDS-PAGE电泳检测显示，纯化获得的目的蛋白正确，且纯度高（大于95％），BCA定量检测得知，共获得732μg的TAT-CT3-cMyc多肽和569μg的CT3-cMyc多肽。
　　 最后，将获得的TAT-CT3-cMyc多肽和CT3-cMyc多肽分别按终浓度10μg/ml、30μg/ml和50μg/ml加入到人早幼粒白血病细胞系HL-60的培养基中，观察其对细胞生长和分化的影响，并探索可能涉及的信号转导通路。免疫荧光检测显示，作用时间1h时，TAT-CT3-cMyc多肽组HL-60细胞内可见明显阳性反应，但10μg/ml组荧光强度较弱，30μg/ml组和50μg/ml组可见强阳性反应。灰度分析提示，30μg/ml组和50μg/ml组的荧光强度无明显差别，这表明TAT-CT3-cMyc确可将融合蛋白片段带入HL-60细胞内，并富集于胞核，且作用时间1h，剂量30μg/ml是较理想的条件。免疫荧光检测还证实，TAT融合多肽进行转导时，其阳性率在80％以上，荧光强度在30min～1h内即可达到峰值，此后随时间延长而下降，至8h左右时，荧光强度已非常弱，但仍可检测到。流式细胞术检测显示，30μg/ml TAT-CT3-cMyc多肽作用8h的HL-60细胞，CD14和CD11b的表达在72h时明显增高，表明TAT-CT3-cMyc多肽确有促进HL-60细胞朝成熟粒细胞方向分化的功能。CCK-8细胞增殖检测显示，与野生型和添加了CT3-cMyc多肽的HL-60细胞相比，添加了TAT-CT3-cMyc多肽（30μg/ml,连续暴露4天，每天8h）的HL-60细胞增殖明显下降，表明TAT-CT3-cMyc多肽的连续应用对HL-60细胞的增殖有明显抑制作用。免疫印迹检测显示，在不添加Jak2抑制剂（AG-490）的情况下，TAT-CT3-cMyc多肽组的HL-60细胞中，pSTAT3的水平最高；添加了Jak2抑制剂后，TAT-CT3-cMyc多肽组的HL-60细胞中，pSTAT3分子仍有较清晰的表达，表明TAT-CT3-cMyc组的pSTAT3是由TAT融合多肽在不依赖于Jak2分子的情况下独立激活的。为了证实TAT-CT3-cMyc组HL-60细胞的分化确实是由STAT3分子激活引起的，我们在各组添加了STAT3抑制剂，并再次在蛋白水平检测了CD14/CD11b的表达。结果显示，3组细胞的CD14/CD11b表达量均有一定程度的减低但TAT无差别，表明pSTAT3的表达量与HL-60细胞的分化程度呈正相关。激光共聚焦显微镜观察发现，与野生型和CT3-cMyc多肽组HL-60细胞相比，TAT-CT3-cMyc多肽组HL-60细胞中tSTAT3和荧光pSTAT3的表达明显增强，表明TAT-CT3-cMyc多肽可以促进HL-60细胞内信号分子STAT3的聚集和激活，启动STATs相应的信号转导通路。
　　 总之，本研究构建了pcDNA3.0-ss-TAT-CT3-cMyc真核表达载体，首次建立了TAT-CT3-cMyc融合蛋白真核表达系统，纯化获得了高纯度且有生物学活性的TAT-CT3-cMyc融合蛋白，并首次发现，TAT-CT3-cMyc融合蛋白可以在短时间内（<1h）高效进入白血病细胞HL-60内，并通过不依赖Jak2的途径激活STAT3磷酸化，促进急性髓系白血病细胞向成熟细胞方向分化并抑制其增殖。这为进一步利用TAT-CT3-cMyc融合蛋白靶向治疗白血病提供了技术支持和理论依据。
　　 小结：
　　 1、TAT-CT3-cMyc融合蛋白可以高效进入白血病细胞HL-60内，促进急性髓系白血病细胞向成熟细胞方向分化。
　　 2、TAT-CT3-cMyc融合蛋白在白血病细胞HL-60内游离存在时，可以以独立于Jak2分子的情况下，激活STAT3磷酸化信号通路，影响其增殖与分化进程。
　　 3、通常情况下只能用原核表达系统制备的TAT融合蛋白在本试验中采用真核表达体系CHO也能大量制备，且在额外添加了信号肽序列后可以分泌出胞，纯化后仍有生物学活性。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

第一部分重组人TAT-CT3-cMyc及对照片段的CHO细胞株的获得与鉴定

第二部分分泌型多肽TAT-CT3-cMyc及对照片段的纯化与鉴定

第三部分分泌型多肽TAT-CT3-cMyc对HL-60细胞的生长调节作用

全文小结

创新点

综述一蛋白转导穿膜域的现状与未来

综述二精原干细胞研究进展

在读期间论文发表和科研工作情况说明

致谢