人HBV/HBx定向敲入P53位点大鼠胚胎干细胞株的建立

摘要

全球约3亿人感染HBV，近千万人患慢性乙型肝炎。其中中国是肝癌高发区，乙型肝炎流行区。据统计，中国占全球HBV表面抗原总携带率的50％。80％以上慢性肝炎患者为慢性乙型肝炎病人，80％以上原发性肝癌的发生都与乙型肝炎病毒感染相关。因此乙型肝炎病毒一直都备受研究者关注，截至目前还没能完全理解乙型肝炎病毒的变异及致病机制，其中一方面原因就是缺少有效的动物疾病模型。
　　 乙型肝炎病毒感染具有明显的种属和组织特异性，为建立理想的动物模型带来很大困难。以前多用HBV转基因小鼠模型，但与人类肝病发生有明显不同。相比之下，大鼠在生理特性等方面更接近于人类，是建立人类疾病的理想动物模型之一。但长期以来，由于无可以生殖传代的大鼠胚胎干细胞株，因此无法建立大鼠基因敲入及敲除模型。至2008年建立了真正意义大鼠胚胎干细胞株(即能生殖传代的大鼠胚胎干细胞株)，2010年成功建立首例大鼠基因敲除模型。大鼠P53基因敲除后自发产生肝癌，有别于小鼠P53基因敲除后很少自发产生癌症，这也从侧面说明大鼠更接近于人类。因此本研究通过构建载体，电转等建立人HBV＼HBx定向敲入P53位点的大鼠胚胎干细胞株，为建立人HBV＼HBx定向敲入P53位点的大鼠模型奠定了基础，便于更好地研究肝癌发生及发展规律，助于发现HBV＼HBx作用过程中新的信号通路，寻找肝癌新治疗靶点，而且可作为药物评估筛选的模型。
　　 因此本课题就是为了建立人HBV＼HBx定向敲入P53位点的大鼠胚胎干细胞株，为后续研究鉴定基础。研究内容包括基因打靶载体的构建，目的打靶细胞系的筛选，嵌合鼠制备及对动物模型进行相关表型分析。
　　 构建基因打靶载体时，为了以后进行相关基因打靶方便，我们先是建立了包括嘌呤霉素和白喉毒素在内的通用载体，然后再通用载体的基础上加两端同源臂，最后在引入的多克隆位点处加HBV全基因组或X蛋白基因序列。构建载体过程中每步都通过三组以上酶切体系跑电泳鉴定，通用载体用测序方式鉴定。
　　 获得的目的质粒用电转的方式导入已建系好的DAc8大鼠胚胎干细胞系中，经过几轮的药物筛选得到发绿色荧光的目的细胞系。并进一步通过PCR和Southern Blot方式鉴定。
　　 通过这项研究为建立人HBV＼HBx定向敲入P53位点的大鼠模型奠定了基础，
　　 便于更好地研究肝癌发生及发展规律，助于发现HBV＼HBx作用过程中新的信号通路，寻找肝癌新治疗靶点，而且可作为药物评估筛选的模型。