鞘内移植新生大鼠背神经节干细胞治疗马尾神经损伤的实验研究

摘要

背景
　　 应用神经干细胞/前体细胞治疗外厨及中枢神经损伤目前在国内外有不少报道。由于神经组织尤其是中枢神经损伤后自身修复能力很差，经传统治疗患者的神经功能往往得不到满意的恢复。神经干细胞具有自我更新和分化潜能，故近年来通过移植神经干细胞治疗神经损伤成为研究的热点。马尾神经损伤导致马尾神经综合征(cauda equina syndrome，CES)是临床常见疾病，目前手术及神经营养药物治疗效果有限，患者往往残留膀胱功能障碍、性功能障碍、鞍区皮肤感觉障碍，严重影响该类患者的生活质量。但关于移植神经干细胞治疗马尾神经损伤的研究目前还未见报道。
　　 本研究应用取自背根神经节的神经干细胞移植治疗马尾神经损伤的研究目前还未见报道。本实验首先建立一个大鼠马尾神经压迫损伤模型，设计将新生大鼠背根神经节干细胞(DRG-NSCs)移植到相应的受损马尾神经周围脑脊液中，以期通过移植DRG-NSCs的增殖、迁移和分化，从而达到修复马尾神经功能的目的。同时观察DRG-NSCs在体外的分化情况。
　　 研究目的
　　 建立稳定的大鼠马尾神经压迫损伤模型。明确蛛网膜下腔显微注射(鞘内移植)方法移植干细胞的可行性。观察新生大鼠DRG-NSCs在受损马尾神经周围脑脊液中和体外的增殖、分化情况。
　　 研究方法
　　 1、从新生2天的SD大鼠中切除背根神经节，分离培养神经干细胞(DRG-NSCs)，经神经球鉴定、培养3代后，用MACS(免疫磁珠筛选系统)筛选Nestin+DRG-NSCs，往Nestin+DRG-NSCs中转入Lentivirus-(e)GFP载体。
　　 2、运用免疫荧光染色方法检测DRG-NSCs的体外分化能力。
　　 3、选取36只出生6周左右的实验SD大鼠，将大鼠随机分为3组：神经干细胞组，n=12；对照组，n=12；假手术组，n=12。设计在前两组每只大鼠的腰4节段咬除椎板，暴露硬膜囊。将长10mm、厚1.0mm、宽1.0mm的硅胶条置入大鼠L5和L6椎管内，建立大鼠马尾神经压迫损伤模型。模型建立7天后，运用甩尾实验判定各实验组大鼠尾部的痛温觉功能变化，确定模型建立成功。假手术组只咬除腰4椎板，不予硅胶条压迫和鞘内注射。
　　 4、模型建立7天后，取出硅胶条，分别鞘内移植GFP-NSCs(大约800,000GFP-NSCs/只)和注射等量的磷酸盐缓冲液(PBS)。术后在设置的时间点内取大鼠马尾神经组织进行免疫组化荧光染色，观察神经干细胞的增殖和分化情况。并定期运用甩尾实验判定各实验组大鼠尾部的痛温觉功能的恢复情况。
　　 结果
　　 1、DRG-NSCs在体外经不含有神经生长因子的分化培养基培养7天后，绝大部分分化为少突胶质细胞。
　　 2、成功建立大鼠马尾神经压迫损伤模型。
　　 3、鞘内移植后发现GFP-NSCs仅在受损马尾神经周围脑脊液中存活一周时间。经免疫组化荧光染色发现，神经干细胞全部分化为少突胶质细胞(04+)，没有发现星型胶质细胞(GFAP+)和神经元(βⅢ-tubulin+)。
　　 4、鞘内移植GFP-NSCs一周后，运用甩尾实验检测发现大鼠尾部的痛温觉功能没有明显恢复。
　　 结论
　　 新生大鼠的DRG-NSCs在体外经不含有神经生长因子的分化培养基培养后绝大部分分化为少突胶质细胞。鞘内移植的NSCs在受损马尾神经周围脑脊液中仅存活一周时间。经免疫组化荧光染色发现，神经干细胞全部分化为少突胶质细胞(O4+)，没有发现星型胶质细胞(GFAP+)和神经元(βⅢ-tubulin+)。甩尾实验检测发现大鼠尾部的痛温觉功能没有明显恢复。