外周神经损伤后TIMPs在大鼠背根神经节中的表达改变及其意义

摘要

背景:
　　 当脊柱疾患发展到后期严重阶段，多通过手术来解除局部压迫，重建脊柱稳定性，从而达到治疗目的。近三十年来，脊柱手术方式及内固定器械已得到极大发展，进行了各种复杂手术，也取得了一些令人鼓舞的疗效，然而部分患者在术后一段时期内仍感到严重而持续的疼痛不适，影响了患者的生活质量及对进一步治疗的信心。既往，我们把这种疼痛产生的原因都归咎于手术失败，但随着研究的深入，我们发现部分患者的疼痛表现有着更深层的病理机制，故称这种疼痛为神经病理性疼痛，其影响全球成千上百万人，就其本身而言，可认为是一种疾病。神经病理性疼痛机制复杂，目前对其了解尚不深刻，虽然根据已有的研究成果采取了一些对症治疗措施，但是疗效有限。
　　 外周神经系统受到损伤可引起神经病理性疼痛，损伤形式多样，包括创伤、疾患、大型手术、肿瘤甚至是化疗等，其疼痛程度不等，可表现为自发性疼痛或诱发性疼痛等不同形式。研究发现，受损神经处可形成神经瘤，产生明显的异位放电；受损神经处和对应的背根神经节中会有明显的炎性细胞浸润；可伴有显著的基因表达调控改变等等。受体和通道性状的改变在神经病理性痛信息传递与调控过程中起至关重要的作用。实验显示，神经损伤后P2X3、TRPV和Nav1.8等通道的表达明显改变；5HT3a、GFRalpha2和GABAalpha5等受体也有明显的表达改变；神经元细胞膜上的Na+-K+泵也有表达改变。此外，神经系统可塑性的改变还包括轴突再生、突触重塑以及炎性因子、神经递质和神经生长因子等的上调或下调等复杂因素。
　　 目前临床用于治疗神经病理性疼痛的药物有多种，但这些药物的作用机理主要是抑制神经元靶体、阻断神经传递，因此，它们可以抑制疼痛症状，但并非是治疗神经病理性疼痛潜在性的病理过程，治疗作用短暂且可产生严重的副作用。
　　 就病理机制而言，神经病理性疼痛被认为是神经可塑性在外周和中枢神经系统中的一种表达形式。最近的研究显示，神经系统中的炎症反应在神经病理性疼痛的发生和发展过程中扮演重要角色。神经损伤后，多种炎性细胞因子，如白细胞介素(IL)-1β，IL-6和肿瘤坏死因子(TNF)-a等，在神经纤维和背根神经节(dorsalrootganglion，DRG)中被诱导表达，对背根神经节神经元胞体和轴突高兴奋性引起的外周敏化过程起重要作用。炎性细胞因子通过增强神经元的兴奋性突触传递，或抑制神经元的抑制性突触传递而产生长效作用。
　　 基质金属蛋白酶(matrixmetalloprotease，MMP)是一大类同源蛋白，具有肽链内切酶活性，可降解细胞外基质的大部分成分，其酶活性的发挥需要Zn2+及Ca2+的存在，现已有近三十种基质金属蛋白酶被确定。基质金属蛋白酶抑制因子(tissueinhibitorsofmetalloproteinase，TIMP)为其内源性抑制物，目前其家族成员共有四种。二者在体内可由成纤维细胞、内皮细胞、软骨细胞、巨噬细胞、中性粒细胞及平滑肌细胞等多种细胞合成和分泌，广泛分布于人体各组织。基质金属蛋白酶通过裂解细胞外基质中的蛋白、细胞因子和趋化因子，在炎症反应过程中发挥重要作用。在MMP家族20多名成员中，具有明胶酶活性的MMP-9和MMP-2最为被研究，MMP-9和MMP-2活性分别受TIMP-1和TIMP-2的抑制。
　　 通过实验动物的脊髓神经结扎(spinalnerveligation，SNL)模型研究，发现脊髓神经结扎后可在背根神经节中诱导迅速(<1天)而短暂(<3天)的MMP-9表达上调，说明在早期阶段，MMP-9的抑制或表达缺失可以减轻神经病理性疼痛，作为MMP-9的特异性抑制物，TIMP-1对神经病理性疼痛的阻断作用在早期阶段特别有效，但在后期阶段则没有作用；而脊髓神经结扎后在背根神经节中MMP-2的表达上调则出现延迟性(>7天)和持久性(>21天)的特点，揭示MMP-2可能触发后期阶段的神经病理性疼痛的发生，MMP-2的作用可被其特异性抑制物TIMP-2所阻断。
　　 综上所述，神经病理性疼痛发生的早期和后期阶段分别有MMP-9和MMP-2的参与，对背根神经节中MMP-9或MMP-2的表达进行抑制，也许可为神经病理性疼痛的预防和治疗提供一种新的思路。因为MMP家族成员众多，在神经病理性疼痛的产生病理机制中，分别起着不同的生理及病理作用，应用广谱的MMP抑制剂可能不会非常有效，并且会产生严重的副作用。而作为MMP的特异性内源性抑制剂，TIMP-1和TIMP-2可通过分别抑制MMP-9和MMP-2的活性，从而显著减轻疼痛反应，故认为TIMP及其衍生物在神经病理性疼痛的治疗上具有一定的潜能。本研究通过建立大鼠外周神经损伤模型，研究神经损伤对TIMP在背根神经节中的表达调控及分布的影响，来更好的理解神经病理性疼痛的发生和发展过程。
　　 研究目的:
　　 本课题通过检测正常大鼠背根神经节(DRG)中的基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)，明确在生理状态下TIMP家族成员是否有表达，及其表达分布；通过切除一段大鼠坐骨神经建立外周神经损伤模型，探讨当外周神经损伤后，TIMP家族成员在大鼠背根神经节中的表达是否发生改变，及其变化趋势。本实验预期通过一系列的相关实验研究达到如下目的：
　　 1、有助于形成一套切实可行的实验动物模型及相关检测模式，为今后的研究做基础；
　　 2、检测在正常生理状态下，TIMP在大鼠背根神经节(DRG)中有表达，不同的TIMP家族成员其表达分布存在差异；
　　 3、揭示当外周神经损伤后，TIMP家族成员在大鼠背根神经节(DRG)中表达或分布的改变趋势；
　　 4、探讨TIMP家族成员在神经病理性疼痛病理机制中的不同作用，以期为神经病理性疼痛的治疗提供新的思路。
　　 研究方法:
　　 将成年Sprague-Dawley雄性大鼠随机分成对照组和实验组，实验组按术后第2天、第70天、第14天及第28天4个不同时间点随机分成4组。在实验组中，结扎并横断大鼠双侧坐骨神经形成动物模型，并于术后分批处死，取L4、L5的背根神经节标本待检测。对照组仅显露坐骨神经，未作其他干预处理，同法取标本待检测。采用Real-timePCR方法检测坐骨神经横断对大鼠背根神经节(DRG)中TIMP-1、TIMP2、TIMP3表达量的影响，并对实验数据进行统计学分析。采用原位杂交(Insituhybridization，ISH)方法显示外周神经横断对TIMP-1、TIMP-2、TlMP-3在大鼠背根神经节中的表达分布的影响。原位杂交实验结束后做免疫荧光标记，显示背根神经节中表达外周蛋白、P2X3、胶原纤维酸性蛋白及转录活化因子3的细胞。
　　 结果:
　　 1、在正常生理状态下，TIMP家族成员TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3在大鼠背根神经节中均有表达；TIMP-1mRNA阳性信号见于背根神经节神经元周围的卫星细胞中，而非神经元中；TIMP-2mRNA阳性信号见于背根神经节初级感觉神经元中；TIMP-3mRNA阳性信号见于背根神经节神经元周围的卫星细胞中。
　　 2、坐骨神经横断后，背根神经节中的TIMP-1mRNA表达水平明显增加，在术后第2天达到峰值，并维持较高水平至术后第28天(与对照相比)，其差异具有显著统计学意义；TIMP-1mRNA的表达上调不仅见于神经元周围，而且在初级感觉神经元中有TIMP-1mRNA的强烈诱导表达；表达TIMP-1mRNA的神经元主要是中小神经元。
　　 3、坐骨神经横断后，背根神经节中的TIMP-2mRNA的表达水平于术后第14天及第28天出现明显降低(与对照相比)，其差异具有显著统计学意义；正常状态下，约80％的神经元含有TIMP-2mRNA，而坐骨神经横断后第14天。TIMP-2mRNA标记神经元所占比率降至约53％。
　　 4、坐骨神经横断后，TIMP-3mRNA的表达水平未发生明显变化，仍主要表达于背根神经节神经元周围的卫星细胞中；仅于术后第2天可见少数背根神经节神经元中有TIMP-3mRNA的诱导表达。
　　 5、坐骨神经横断后2天，于胶原纤维酸性蛋白(GFAP，显示卫星细胞活性的一种标志物)阳性的卫星细胞中可见TIMP-1mRNA表达上调；约70％的TIMP-1mRNA阳性标记神经元为外周蛋白阳性细胞，而70％的外周蛋白阳性神经元中含有TIMP-1tuRNA。TIMP-1mRNA标记神经元中仅约46％的神经元为P2X3阳性细胞，而约72％的P2X3阳性神经元中含有TIMP-1mRNA。
　　 6、坐骨神经横断后2天，约94％的TIMP-1mRNA标记神经元为ATF-3阳性神经元，而约89％的ATF3阳性神经元为TIMP-1mRNA标记神经元。
　　 结论:
　　 TIMP-1作为MMP-9的内源性抑制物，可在早期阶段逆转机械性异常疼痛；而TIMP-2作为MMP-2的内源性抑制物，则在后期阶段有镇痛作用。本实验通过检测在外周神经损伤后的不同时间段，TIMP-1、TIMP-2及TIMP-3在大鼠背根神经节中表达量及表达分布的改变，初步阐明了TIMP-1、TIMP-2及TIMP-3的不同表达模式。实验动物在术后一天即出现伤害性感受表现，说明在外周神经损伤的早期阶段，背根神经节中TIMP-1的显著上调不能中和MMP-9引起的疼痛效应。同时，神经损伤后诱导产生TIMP-1mRNA的神经元并非限定于背根神经节神经元的某个亚群，说明在背根神经节神经元中TIMP-1mRNA的表达也许与神经营养因子无关。TIMP-1mRNA主要在损伤背根神经节神经元中被诱导，说明ATF-3可能是TIMP1mRNA表达的关键因素。TIMP-2mRNA在外周神经损伤的后期阶段出现表达下调，导致MMP-2和TIMP-2间的平衡趋向于MMP-2，这也许可以解释神经病理性疼痛持续的原因。