烟曲霉感染对气道上皮细胞Dectin-1受体表达影响及其机制研究

摘要

随着免疫抑制高危人群的不断增加，真菌感染的发病率呈现上升趋势，侵袭性真菌感染(invasivefungalinfection，IFI)成为医学界备受关注的问题。即使通过不断改进的检测手段早期诊断，采取预防性治疗和经验性治疗等措施，其死亡率仍高达50％-90％。近年抗真菌药物研究取得很大进步，但仍面临治疗有效率低和耐药菌不断产生等问题。随着对烟曲霉感染宿主机制研究的不断深入，对机体免疫防御反应研究的不断深化，宿主天然免疫功能及其组成的免疫屏障(immunologicalbarrier)在烟曲霉感染过程中发挥的防御作用日渐受到重视，可能从干预宿主免疫状态角度，为曲霉病防治提供新的思路。
　　 气道上皮细胞(respiratoryepitheliums，REs)被认为是与天然免疫功能联系最为密切的组织细胞，具备双向调节免疫功能的能力，其可被诱导的天然免疫防御功能(inducibleinnateresistance)构成了强大的免疫屏障，在宿主抗病毒、细菌和真菌感染免疫反应中发挥重要作用。REs作为机械屏障(mechanicalbarrier)首先接触到吸入的烟曲霉孢子，其对烟曲霉的识别是宿主有效清除和杀灭烟曲霉孢子的始动环节，对病原体相关分子模式(pathogen-associatedmolecularpatterns，PAMPs)的识别作用是抗真菌免疫的始动点。Dectin-1受体是参与抗真菌免疫的主要模式识别受体(patternrecognitionreceptors，PRRs)，可以特异性的识别烟曲霉细胞壁成分β-葡聚糖，介导宿主抗真菌免疫防御反应。现有研究表明静息状态下，REs细胞膜表面Dectin-1受体表达水平极低，但在与分枝杆菌相互作用时，分支杆菌细胞壁成分β-葡聚糖能够诱导REs表达Dectin-1受体，并发挥杀菌和免疫调理作用。本实验拟建立REs烟曲霉感染模型，观察细胞Dectin-1受体表达变化及相关影响因素，评价Dectin-1受体的表达变化在REs天然免疫防御功能调节中的作用。
　　 第一部分，烟曲霉感染对气道上皮细胞Dectin-1受体表达影响
　　 目的：通过建立烟曲霉感染人气道上皮细胞(humanbronchialepithelialcells，HBE细胞)的体外模型，在mRNA、蛋白和细胞水平观察烟曲霉感染HBE细胞不同感染时间Dectin-1表达变化，以探讨宿主抗烟曲霉免疫防御功能的调节机制。
　　 方法：HBE细胞感染烟曲霉孢子，感染复数(multiplicityofinfection，MOI)为1。在不同时间点终止感染，提取细胞总RNA，总蛋白，或使用抗体标记细胞膜表面Dectin-1受体。采用Real-timePCR方法检测Dectin-1受体mRNA表达水平，聚光共聚焦显微镜观察细胞膜表面Dectin-1受体表达变化，流式细胞仪检测细胞Dectin-1受体表达水平。
　　 结果：Real-timePCR检测发现，HBE细胞感染烟曲霉孢子6小时后，Dectin-1mRNA表达即显著增加，在感染后18小时仍维持在较高水平，其表达是感染前25倍左右。在蛋白水平聚光共聚焦显微镜观察发现，HBE细胞表面绿色荧光标记的Dectin-1受体表达水平随着感染时间的延长显著增强，在感染后24小时达到高峰。在细胞水平流式细胞仪进一步证实，标记HBE细胞Dectin-1受体检测发现，感染后6小时，HBE细胞膜表面Dectin-1受体表达即显著增加。
　　 结论：HBE细胞静息状态下Dectin-1受体表达水平极低，在烟曲霉孢子感染过程中，HBE细胞能够在不同水平启动Dectin-1受体表达。这一现象可能在HBE细胞应对烟曲霉感染的免疫防御调节过程中发挥重要作用。
　　 第二部分，Dectin-1启动表达在气道上皮细胞抗烟曲霉感染免疫防御中的作用
　　 目的：通过建立烟曲霉感染HBE细胞的体外模型，观察细胞天然免疫防御反应变化，及其与Dectin-1启动表达的相关性。
　　 方法：HBE细胞感染烟曲霉孢子，MOI为1，感染后6小时和18小时终止感染实验，在mRNA观察HBE细胞TNF-α，GM-CSF，IL-6和IL-8等炎症趋化因子以及人防御素(Humanβ-defensin，HBD)1、2、9和抗菌肽LL-37表达水平。进一步转染Dectin-1siRNA沉默Dectin-1表达，观察以上炎症趋化因子和抗菌肽的表达变化。同时利用激光共聚焦显微镜观察Dectin-1表达变化对HBE细胞活性氧(Reactiveoxygenspecies，ROS)释放水平的影响。
　　 结果：结果显示烟曲霉感染后，HBE细胞TNF-α，GM-CSF、IL-8、HBD2和9在感染后6小时即显著升高，并在24小时仍维持高表达。Dectin-1siRNA转染HBE细胞后能有效沉默Dectin-1受体表达。在抑制Dectin-1表达后，TNF-α，IL-8，HBD2和HBD9上调表达的现象显著受到抑制。ROS的释放水平也因Dectin-1受体的沉默而显著受到抑制。
　　 结论：烟曲霉感染诱导气道上皮细胞表达多种炎症趋化因子和抗菌肽，发挥免疫防御作用。通过沉默Dectin-1受体表达，发现TNF-α，IL-8，HBD2和HBE9的表达以及ROS的合成受到抑制。Dectin-1受体的表达以及其对烟曲霉的识别在免疫防御调节过程中发挥重要作用。
　　 第三部分，气道上皮细胞Dectin-1表达影响因素观察
　　 目的：探讨气道上皮细胞Dectin-1启动表达的影响因素。
　　 方法：通过转染siRNA抑制HBE细胞Toll样受体2(Toll-likereceptor2，TLR2)的表达，构建HBE细胞烟曲霉感染模型，进一步观察HBE细胞Dectin-1受体表达变化。
　　 结果：HBE细胞在静息状态下即表达TLR2受体蛋白，通过siRNA转染可沉默HBE细胞TLR2受体表达。在烟曲霉感染时，TLR2受体沉默显著抑制了Dectin-1受体上调表达现象。
　　 结论：结果显示HBE细胞静息状态下TLR2受体蛋白表达维持在较高水平。HBE细胞启动Dectin-1受体的表达是建立在TLR2对烟曲霉早期识别的基础上，并通过TLR2下游信号通路启动Dectin-1受体表达。
　　 第四部分，气道上皮细胞Dectin-1转录调节机制研究
　　 目的：初步探讨气道上皮细胞转录水平调节Dectin-1受体表达的机制。
　　 方法：通过生物信息学方法寻找调节Dectin-1受体表达的相关转录因子，并进一步观察相关转录因子在烟曲霉感染HBE细胞过程中的功能性分布变化。
　　 结果：生物信息学方法检索发现，Dectin-1基因5’非编码区含有转录因子PU.1启动子序列。通过HBE细胞烟曲霉感染实验，进一步发现在烟曲霉感染时，细胞核内PU.1蛋白含量显著增加。
　　 结论：生物信息学检索发现转录因子PU.1具备参与气道上皮细胞Dectin-1转录表达调控的生物学活性。烟曲霉感染研究发现HBE细胞中，转录因子PU.1发生了核转位，其功能活化可能参与了Dectin-1受体的表达。