p62在大鼠慢性脊髓损伤中的作用机制研究

摘要

研究目的:随着科技进步和人类平均年龄的增加，中老年脊柱退变性疾病发病率越来越高，慢性脊髓损伤尤为常见，严重影响生活质量。脊柱退行性改变导致慢性机械性脊髓损伤，造成运动和感觉功能的隐匿性和持续性进展。慢性脊髓损伤严重影响患者的生活质量，给家庭和社会带来了沉重的负担。慢性脊髓损伤机制尚未阐明，慢性脊髓损伤是由于多种因素所导致的，发病机制不明，虽然有许多针对该领域的研究，但都未获得明确的病因。近年来，凋亡反应在脊髓损伤中的研究越来越多，参与慢性脊髓损伤的凋亡通路很多，包括经典的Fas信号通路途径。近年来，有研究者发现，p62与NFkB介导的凋亡通路密切相关，但未见针对慢性脊髓损伤的相关研究，p62可能在慢性脊髓损伤中发挥重要作用。因此，本研究通过建立慢性脊髓损伤动物模型，初步探索p62在慢性脊髓损伤中的作用。
　　 研究方法:采用后路慢性压迫装置造成SD大鼠T8的脊髓慢性损伤。将36只SD大鼠分为对照组，1周、4周、8周、12周和16周模型组。首先，通过自制的后路慢性脊髓压迫装置，固定在大鼠的T7至T9水平，通过间断的螺钉拧入，连续6周每周拧入1个螺距0.3mm，造成脊髓慢性压迫，6周后停止拧入，持续观察。对出现术后并发症或神经功能急性损伤大鼠采取废弃处理，及时补充每组的模型动物数量。慢性压迫螺钉每周拧入一个螺距0.3mm，连续拧入6周，后10周采取静态观察，不再拧入。每4周进行X线检测螺钉压迫程度，通过HE染色观察大体形态变化，采用PCR和Western Blot检测p62、NFkB、LC3、caspase3在造模后不同时间点的表达量，通过免疫组化观察上述指标在不同时间点的表达变化情况，通过TUNEL检测术后不同时间点的凋亡进展。活体动物神经功能评分方面，采用BBB评分进行神经功能评价，观察术后不同时间点的大鼠神经功能变化情况。
　　 结果:造模后复查侧位片提示慢性压迫装置在位，造成椎管内压迫。大鼠的运动和感觉功能障碍出现在造模后1周和8周时，神经功能评分降低(18.33±0.82;14.83±0.75;12.67±0.82)，与对照组相比有统计学意义(P=0.000; P=0.000; P=0.000)，提示慢性压迫造成了神经功能障碍。至造模后12周及16周神经功能BBB评分略有升高(14.83±0.75;16.0±0.82，P=0.000; P=0.000)，但与对照组相比，均有统计学意义(P＜0.05)。组织学方面，造模后1周时，HE染色切片观察未见明显神经元变性以及白质的髓鞘改变;4周时出现轻度的神经元变形以及白质的脱髓鞘改变，出现少量空泡样变性;造模后8周时出现神经元固缩变性，白质空泡样改变，脱髓鞘改变。造模后12周时，出现较为明显的神经元变性，空泡样变以及空泡样变;造模后16周时，神经元广泛变性，空泡样变加重，脱髓鞘改变更加明显。TUNEL凋亡检测发现从造模后1周开始出现阳性细胞，持续表达至造模后16周，逐渐出现核固缩碎裂等典型的凋亡特征。PCR结果提示，造模后p62的表达持续增加，造模后至12周时，p62的表达持续增加，至造模后16周时，表达相对值较12周略有下降;LC3、NFkB以及caspase3结果均提示造模后1周至16周，上述基因的表达量均持续增加;WB结果提示，p62的表达量至造模后12周时表达量持续增加，12周至16周时增加不明显，LC3、NFkB以及casepase3的表达量在造模后各时间点均显著增加。
　　 结论:大鼠的后路慢性压迫装置能够较稳定的模拟慢性脊髓损伤疾病，可重复性好，通过对慢性脊髓损伤大鼠的观察，可见大鼠慢性脊髓损伤后出现慢性脊髓病理改变过程，逐渐出现神经元变性以及脱髓鞘改变。此外，慢性脊髓损伤后在不同时间点， p62在大鼠慢性脊髓损伤后表达持续增加，参与了慢性脊髓损伤后的病理机制过程，提示p62的积聚可能与慢性脊髓损伤的发生发展有关。随着慢性脊髓损伤后p62的表达增加，相应的NFkB、LC3和easpase3的表达也相应增加，且免疫组化结果可见p62与NFkB同时在神经元胞核内表达，进一步提示p62可能参与NFkB介导的脊髓损伤后凋亡反应，在其中发挥一定的作用，但其确切机制仍需要进一步研究。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一部分 大鼠慢性脊髓压迫动物模型的建立

一、材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第二部分 p62在慢性脊髓损伤中的表达

1 材料与方法

2．结果

3．讨论

参考文献

第三部分 p62介导的NFkB信号通路在慢性脊髓损伤中的作用机制研究

1 材料与方法

2．结果

3．讨论

参考文献

全文总结

综述一：脊髓型颈椎病动物模型的研究进展

综述二：颈脊髓慢性压迫损伤机制的新进展

综述三：P62的生理与病理作用机制的研究新进展

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