内镜超声探头引导下乙醇瘤内注射治疗胰腺癌的实验研究

摘要

胰腺癌是常见的恶性肿瘤之一，恶性程度高，每年导致全球超过250，000人死亡。随着诊疗水平的提高和生活方式的改变，我国胰腺癌的发病率有逐年提高的趋势，资料显示，我国胰腺癌的发病率自20世纪50年代至90年代增加了近5倍。由于胰腺癌早期缺乏典型临床表现，待明确诊断时90％患者已出现局部浸润及远处转移而无法根治性切除。尽管吉西他滨已成为治疗晚期胰腺癌患者的标准化疗药物，一定程度上延长了患者的生存期，但其1年生存率仅为20％左右。
　　 内镜超声(endoscopic ultrasonography, EUS)应用于临床已有30多年，早期EUS仅作为一种诊断方法应用于临床。近年来，随着EUS技术的发展及线阵超声扫描探头的应用，使得EUS引导下细针穿刺活检(EUS guided fine-needle aspiration，EUS-FNA)在临床应用取得重大进展，在此基础上经EUS引导下胰腺癌的介入治疗也进一步发展起来，出现了EUS引导下细针注射治疗、消融治疗、光动力学治疗、基因治疗和放射性粒子植入等治疗方法。尽管有些技术处于实验研究阶段，但胰腺病学界对晚期胰腺癌局部介入治疗研究的热情正持续高涨。近年来也有EUS引导下给予乙醇注射治疗胰腺肿瘤的报道。
　　 超声引导下无水乙醇注射在肾囊肿、肝囊肿及原发性肝癌等治疗方面已取得较好的疗效。近年来，EUS引导下乙醇注射在胰腺肿瘤治疗中也取得一定的进展。为了评价乙醇在胰腺肿瘤治疗方面的安全性，有研究者在EUS引导下对正常猪胰腺组织进行乙醇注射，结果发现接受乙醇注射的实验动物均无胰腺炎的发生，并在胰腺注射部位出现炎性、坏死和纤维化，认为乙醇应用于胰腺肿瘤的治疗是安全的。有文献报道了EUS引导下乙醇灌注及乙醇灌注加紫杉醇治疗胰腺囊性肿瘤，取得较好的疗效，没有严重并发症的发生。另外，有一些关于EUS引导下乙醇注射治疗胰腺神经内分泌肿瘤的报道，因患者拒绝接受手术治疗，在EUS引导下给予乙醇注射治疗，治疗后均取得较好的疗效，没有严重并发症的发生。
　　 高浓度乙醇消融治疗的机制是利用乙醇对肿瘤组织的迅速脱水固定作用，使蛋白质发生变性，肿瘤内血管收缩，血管壁变性及内皮细胞破坏，局部血栓形成，导致组织坏死，同时可使肿瘤细胞破坏，并引起炎性细胞浸润和成纤维细胞增生，进而发生纤维化，达到最大程度灭活肿瘤细胞。高浓度乙醇给于瘤内注射后，随着乙醇向周围扩散，会形成一个从注射点到周围肿瘤组织的乙醇浓度梯度，乙醇浓度高的地方，肿瘤细胞会发生脱水，变性，导致肿瘤组织坏死，但是周围浓度低的区域不足以使肿瘤细胞发生坏死，是否有其它的效应及机制还不清楚。近年来，国内外均有报道低浓度乙醇可以诱导肠上皮细胞、神经细胞、角膜细胞以及肝癌细胞等多种细胞凋亡。乙醇浓度从几毫摩尔到几百毫摩尔，也有报道以乙醇在培养基中体积百分比代表其浓度。有研究者用低浓度乙醇体外处理肝癌细胞，结果发现低浓度乙醇可通过死亡受体途径诱导肝癌细胞凋亡。
　　 基于以上的研究，我们尝试进行高浓度乙醇治疗胰腺癌的实验研究，首先通过皮下移植瘤模型筛选治疗胰腺癌合适的乙醇浓度，再构建裸鼠原位胰腺癌模型，在EUS探头引导下行乙醇瘤内注射治疗，评价乙醇治疗胰腺癌的安全性及其疗效，并进一步探讨弥散至肿瘤周围的低浓度乙醇是否可诱导肿瘤细胞凋亡，为乙醇治疗胰腺癌提供理论基础和依据。实验主要包括以下三个部分:
　　 一、不同浓度乙醇对裸鼠移植性胰腺癌治疗疗效观察的实验研究
　　 目的评价不同浓度乙醇瘤内注射治疗裸鼠移植性胰腺癌的疗效，为临床选择治疗疗效好且毒副作用少的乙醇浓度来治疗胰腺癌提供实验依据。
　　 方法构建胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型，选肿瘤大小相近的裸鼠48只，将其随机分为6组，每组8只，A组:0％乙醇组（生理盐水），B组:20％乙醇组;C组:40％乙醇组;D组:60％乙醇组;E组:80％乙醇组;F组:95％乙醇组。治疗前后用游标卡尺测量肿瘤最长径(a)和最短径(b)，计算肿瘤体积，并计算相对肿瘤体积(RTV)和相对肿瘤体积增殖率(T/C)。治疗后第7天处死裸鼠，取肿瘤组织行病理组织学检查。
　　 结果20％乙醇治疗组的RTV和T/G与对照组接近(P=0.212);40％、60％、80％和95％治疗组的RTV明显低于对照组(P＜0.01)，其中60％、80％和95％治疗组的T/G低于30％;80％和95％治疗组的RTV明显低于60％治疗组（P=0.003和P=0.009），而80％和95％治疗组的RTV接近(P=0.819)。病理组织学显示对照组(0％)未见肿瘤坏死，20％和40％乙醇组肿瘤瘤体内可见少量坏死，而60％、80％和95％乙醇组的瘤体内出现大面积凝固性坏死。
　　 结论80％乙醇瘤内注射治疗裸鼠皮下移植性胰腺癌可达到与95％乙醇治疗组相似的疗效。
　　 二、内镜超声探头引导下乙醇瘤内注射治疗胰腺癌的实验研究
　　 目的评价80％乙醇瘤内注射治疗裸鼠原位胰腺癌的疗效及其安全性，以期为晚期胰腺癌微创介入治疗提供新的治疗方法。
　　 方法构建裸小鼠原位胰腺癌模型，选肿瘤大小相近的原位胰腺癌裸鼠20只，随机分为2组，每组10只:实验组:80％乙醇;对照组:生理盐水。在EUS探头引导下将药物局部注射至裸小鼠瘤体内。治疗前及治疗后第7天在EUS探头引导下测量肿瘤大小，计算肿瘤体积、相对肿瘤体积（RTV）和相对肿瘤体积增殖率(T/C)。治疗前和治疗后24h检测血清淀粉酶。光学显微镜下观察治疗前后肿瘤组织病理改变。
　　 结果实验组相对肿瘤体积（RTV）明显低于对照组(0.47±0.09 v1.24±0.04，P＜0.01);实验组T/C％=38％。实验组治疗后24h血清淀粉酶出现轻度增高，但治疗前后对血清淀粉酶的影响无统计学差异(P=0.059)，与对照组相比，实验组对淀粉酶的影响也无统计学差异(P=0.13)。病理组织学检查显示实验组肿瘤坏死变性严重，有大面积凝固性坏死，而对照组仅见少量坏死。
　　 结论80％乙醇瘤内注射可造成肿瘤坏死，在裸鼠原位胰腺癌模型中有一定的治疗效果。
　　 三、低浓度乙醇诱导人胰腺癌细胞凋亡的研究
　　 目的探讨低浓度乙醇对胰腺癌细胞株凋亡的诱导作用。
　　 方法用含不同浓度乙醇（0％、2％、4％和6％）的培养液培养胰腺癌细胞株SW1990，培养6h后，用CCK8法检测不同浓度乙醇对胰腺癌细胞株细胞增殖的影响，流式细胞术检测细胞的凋亡。实时荧光定量PCR法检查凋亡相关基因caspase8 mRNA、caspase9mRNA的表达水平变化;westernblot检测caspase3蛋白表达水平的变化。结果低浓度乙醇可抑制SW1990细胞的增殖，随着浓度的增加，细胞存活率明显下降，与对照组（0％组）相比均有统计学差异(P＜0.05)。流式细胞检测显示2％、4％和6％乙醇组均可诱导细胞凋亡，与对照组（0％组）相比均有统计学差异(P＜0.05)。caspase8 mRNA在2％、4％和6％乙醇组的表达与对照组相比未见明显增加(P＞0.05);而caspase9 mRNA在2％、4％和6％乙醇组中的表达均增加，且与对照组相比均有统计学差异(P＜0.05)。活性的caspase3蛋白在2％、4％和6％乙醇组中均有表达，而对照组未见活性的caspase3蛋白的表达。
　　 结论低浓度乙醇对胰腺癌细胞SW1990具有明显的诱导凋亡作用，其诱导凋亡的机制可能通过线粒体途径来完成。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

前言

第一部分 不同浓度乙醇对裸鼠移植性胰腺癌治疗疗效观察的实验研究

一、材料与方法

二、实验结果

三、讨论

第二部分 内镜超声探头引导下乙醇瘤内注射治疗胰腺癌的实验研究

一、材料与方法

二、实验结果

三、讨论

第三部分 低浓度乙醇诱导人胰腺癌细胞株凋亡的研究

一、材料与方法

二、实验结果

三、讨论

全文总结

参考文献

综述一 Endoscopic Ultrasound—Guided Ethanol Ablation Therapy for Tumors

综述二 内镜超声引导下细针注射治疗在胰腺肿瘤中的应用进展

综述三 超声内镜在胰腺肿瘤治疗中的应用进展

在读期间发表论文和参加科研工作情况说明

致谢